שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים
Summary
We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.
Abstract
מניפולציה והתרבות של עוברי עכברים מוקדם היא עדיין חזקה במידה רבה בטכנולוגית שיפור הערך של מערכת מודל זה תחת שימוש. לעומת זאת, תרבית תאים כבר בשימוש נרחב במחקרי ביולוגיה התפתחותית. עם זאת, חשוב לקבוע אם במבחנה תאים בתרבית באמת מייצגים בסוגי vivo תא. השתלת תאים לעוברי, ואחריו הערכה על תרומתם בפיתוח היא שיטה שימושית כדי לקבוע את הפוטנציאל של תאים בתרבית במבחנה. במחקר זה, אנו מתארים שיטה להשתלת תאים לאתר מוגדר של עוברי עכברי postimplantation המוקדם, ואחריו תרבות לשעבר vivo. גם אנחנו מציגים את שיטת electroporation מותאמת המשתמשת בנימי זכוכית בקוטר ידוע, המאפשרת לוקליזציה והתאמה מדויקות של מספר התאים מקבלים DNA אקסוגני עם שתי יעילות transfection גבוהה ומוות של תאים נמוכים. טכניקות אלה, שאינם דורשים כל spציוד ecialized, לעבד מניפולציות ניסיוניות של gastrulation ועובר עכבר organogenesis שלב מוקדם אפשרי, ניתוח המאפשר למחויבות בתת אוכלוסיות תאים בתרבית ואת ההשפעה של מניפולציות גנטיות באתר על התמיינות תאים.
Introduction
תרבית תאים כבר בשימוש נרחב במחקרי ביולוגיה התפתחותית. תאי גזע העובריים של עכבר (ESCs) ותאי גזע epiblast (EpiSCs) יכולים להתמיין לכל שלוש השכבות הנבט במבחנה והם מודל שימושי להתמיינות תאים בעובר יונקים המוקדם. הגזירה של שורות תאים אלה נפתחה הזדמנות למניפולציה במבחנה וחקירה מפורטת של האירועים מקומי איתות ורשתות תעתיק הפועלים בדפוסים עובריים מוקדמים. עם זאת, הוא נשאר חשוב לקבוע את הרלוונטיות vivo של כל מניפולציות שבוצעו בתרבות. פוטנציאל in vivo של ESCs עכבר נגזר עובר preimplantation כבר העריך ידי החדרת אותם בחזרה לעוברי preimplantation (morulae או blastocysts) 1. עם זאת, EpiSCs המייצגים את תאי epiblast בעוברי postimplantation לא יכול לשלב ביעילות בעוברי preimplantation 2,3. previoשלנו ממצאים הראו כי יעילות EpiSCs יכול ליצור מפלצות ולתרום לכל השכבות הנבט, כאשר מורכב לעוברי postimplantation 4. לפיכך, הדרך הטובה ביותר להעריך התאים בתרבית במבחנה היא להציג אותם לסביבתם המקבילה in vivo.
Electroporation הוא שיטה נפוצה כדי לספק מולקולות אקסוגניים לתאים ממוקדים בשני in vivo ובניסויי מבחנה. אנרגיה חשמלית יכולה לייצר מספר רב של נקבוביות בקרום התא, המאפשר חומצה דאוקסיריבונוקלאית אקסוגניים (DNA) או חומצה ריבונוקלאית (RNA) כדי להזין את התאים. אחד האתגרים הגדולים ביותר עבור טכניקה זו היא לשלב כדאיות תא אופטימליות עם 5,6 יעילות הגבוה electrotransfection. Electroporation של חומצות גרעין ברקמות עובריות, מצופה זהב אלקטרודות שהנפוצות ביותר בשימוש, המאפשר מיקוד של תאים במגוון רחב מרחבי 7-9. כדי להשיג loca יותרהעברת גני lized, אלקטרודה בצורת מחט נוצלה כדי להשיג שדה חשמלי מוקדי 10,11. באמצעות שיטה זו, המחברים הראו כי לאחר electroporation, סביב 30-60 תאים לקחו את ה- DNA לבנות 11. עם זאת, נראה כי באופן מדויק התאמת מספר תאי electroporated עדיין קשה עם אלקטרודה ברוחב קבוע. טכניקת electroporation הנימים נעשתה שימוש כדי לספק פלסמידים לתאים בודדים 12-14. עם זאת, טכניקה זו לא יושמה לelectroporating פלסמידים לעוברי vivo לשעבר. לאחרונה, microdevice דווח מקומי electroporate כמה תאי דיסטלי קרביים האנדודרם (פחות מ 4 תאים) בעוברי עכבר postimplantation המוקדם 15. עם זאת, זה עדיין לא ידוע אם מכשיר זה ביעילות יכול למקד האאקטודרם והמזודרם vivo לשעבר.
במחקר זה אנו מתארים שתי שיטות רומן כדי להעריך את התפקוד תאי וגנטי בהודעה המוקדמת-implantation עוברים. אנו מדגימים כיצד להשתיל ראשון במבחנה תאים בתרבית לאתרים שהוגדרו בעוברי עכברים מוקדם להעריך את הפוטנציאל שלהם in vivo. השילוב של התאים המורכבים וצאצאיהם, כל שכותרתו על ידי תג גנטי (למשל, חלבון ניאון ירוק (GFP), ניתן לבדוק עוד יותר על ידי immunostaining של חלבונים ספציפיים רקמה 4. שנית, אנו מתארים שיטה משופרת להעביר דנ"א בדיוק לאתרים מקומיים בעובר דרך electroporation. במקום להשתמש באלקטרודה בצורת מחט, הכנסנו חוט דק בתוך נימי זכוכית שקצהו קנס, ולהוכיח כי שינוי זה יכול לספק DNA למספר קטן של תאים עם יעילות גבוהה ומוגבל תא מוות. יתר על כן, אנו מראים כי באמצעות נימי זכוכית בגדלים שונים פתיחה, אנחנו יכולים לשלוט על מספר תאי electroporated. לכן, אנו מאמינים בשיטה זו יכולה להיות תועלת רבה ללמוד דפוסים עובריים מוקדמים מעורבות מספרים קטנים oתאים ו.
Protocol
Representative Results
Discussion
הארכת
השלב הקריטי לניסויי השתלת תאים הוא החדרת מחרוזת עקבית של תאים באופן אידיאלי בפעולה אחת, כדי למנוע התפרקות של הגוש. טכניקה זו דורשת קצת תרגול בשליטה פיפטה הפה. אם תאי תורם לשלב גם במארח, הנגזרים שלהם יתפזרו בעובר. כדי לקבוע אם נוסף נגזר תאי התורם התפזר להבחין כראוי במארח, immunostaining יכול להתבצע על חלקי העובר. אם תאי תורם אינם תואמים לסביבת המארח, הם גם לא יכולים להיות מזוהים (כפי שהם גורשו מהעובר) או ליצור גושים מאוגדים בעוברים לאחר התרבות. אם שני תאים מפוזרים וגושי תא נצפו, זה עשוי להצביע על כך יותר מדי תאים היו מורכבים ותאי תורם מוגזמים שלא יכול לקיים אינטראקציה עם תאי מארח סביב הביאו היווצרות גוש. במקרה זה, שתלי נוספים המכיליםמספר קטן יותר של תאים יכול להתבצע.
המגבלה העיקרית של טכניקת השתלת תאים הוא שזה לא ניתן לקבוע את מלוא פוטנציאל in vivo של תאים מאז תרבות עכבר לשעבר vivo על פני תקופות ארוכות מ -48 שעות לא הושגו. עם זאת, אם בשילוב עם הזרקת תא מודרך אולטרסאונד, ייתכן שניתן להעביר תאים בתרבית לעוברים ברחם. לסיכום, ניסויי תא השתלה היו בשימוש נרחב בקבוצה שלנו ונתנו לנו רמזים חשובים על פוטנציאל in vivo של סוגי תאים שונים 4,21,22. זוהי טכניקה של שירות כללי להעריך את פוטנציאל in vivo של במבחנה תאים בתרבית בעוברי postimplantation המוקדמים.
Electroporation
למרות במחקר זה הראינו רק שזה יעיל להשתמש בטכניקת electroporation הנימים למקד epiblast, אנילא ניתן גם לכוון במכוון שכבות נבט אחרות כגון תאים האנדודרם. השלב הקריטי לטכניקת electroporation הנימים הוא למזער את הזמן שלוקח לelectroporate כל עובר (<5 דקות לכל עובר) מאז PBS הוא הכי מוצלח מאוד לעוברי עכברים מוקדם. הנתונים שלנו מעל הראו כי, ברוב האזורים בעוברים, electroporation אינו משפיע על צמיחת העובר. עם זאת, electroporation בצומת גרם התפתחות לא תקינה והביא למותו בטרם עת של העובר. זה עשוי בשל נזק או מוות של התאים היוצרים מרכזי איתות חשובים 23. לפיכך, אזור זה יצטרך להימנע עם טכניקה זו. אזהרה נוספת היא ש, כאמור בסעיף התוצאות, תוך epiblast או תאי פס פרימיטיביים היו ממוקדים, כמה תאים האנדודרם היו גם electroporated. זה יכול להיות בגלל DNA מגיע להאנדודרם דרך פערים באפיתל epiblast. האנדודרם מורכב מתאי אפיתל ובניסיון שלנו היש תאים ESE נטייה גבוהה יותר כדי לקחת את ה- DNA. לכן, בעת יישום טכניקה זו למיפוי גורל, חשוב להעריך שבו תאים בתחילה לקחת את ה- DNA.
צריך גם לציין שלמרות שpCAG-GFP וpCAG-Cre: פלסמידים GFP יכולים להיות מועברים בצורה יעילה באמצעות פרמטרי electroporation מוצגים במחקר זה, את היעילות של בונה DNA אחרת עשויה להיות שונה וצריך אופטימיזציה בודדת. שינויים בריכוז ה- DNA, מתח electroporation או מספר הפעימות יכולים להתבצע אם פלסמידים הם מצאו להיות קשה transfect.
לסיכום, מערכת electroporation שלנו מותאמת נימים יכולה ביעילות ובreproducibly לספק GFP או Cre: פלסמידים GFP למעט מאוד תאים בעובר עם מוות של תאים מוגבלים. מאחר ושיטה זו אינה דורשת ציוד יקר או מאוד מיוחד, זה יכול להיות תועלת רבה ללימודי מעקב תא או בבדיקת ההשפעה של ביטוי חוץ רחמי או o מחיקה המותנהגני F בעוברים מוקדמים, אם electroporation מבוצעים בעוברים שנשאו אללים מוטציה מותנים floxed. לכן, טכניקת electroporation זה מספקת כלי פונקציונלי שימושי להבנה על בסיס תא-ידי תאי התפקידים של גורמי תא פנימי בהקשר של סביבות עובריות wildtype המקומי.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council
Materials
| Forceps | Dumostar | T5390 | |
| Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
| Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
| Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
| Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
| 30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
| 4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
| tips | Greiner Bio One | 685280 | |
| Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
| Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
| Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
| Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
| Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
| Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
| Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
| Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
| A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
| pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
| pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
| Multimeter | Excel | XL830L | |
| Micromanipulators | Leitz | ||
| 0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
| Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
| Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
| A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |
References
- O’Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists. Pulmonary med. , 894063 (2012).
- Brons, I. G., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448, 191-195 (2007).
- Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448, 196-199 (2007).
- Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation. Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).
- Sadik, M. M., et al. Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation. Biophys. J. 106, 801-812 (2014).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).
- Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo. Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).
- Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation. JOP. 6, 128-135 (2005).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).
- Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation. Genesis. 35, 57-62 (2003).
- Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum. CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Nolkrantz, K., et al. Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary. Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).
- Mazari, E., et al. A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage. Development. 141, 2349-2359 (2014).
- Copp, A. J., Cockroft, D. L. . Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , (1990).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).
- Wilson, V., Beddington, R. S. Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak. Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis. Dev Cell. 17, 365-376 (2009).
- Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent. Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).
- Tsakiridis, A., et al. Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors. Development. 141, 1209-1221 (2014).
- Gouti, M., et al. In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity. PLoS biology. 12, e1001937 (2014).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120, 613-620 (1994).
