طرق لنقل المترجمة على وجه التحديد من الخلايا أو الحمض النووي في Postimplantation المبكر أجنة الفئران
Summary
We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.
Abstract
التلاعب وثقافة أجنة فئران في مراحلها المبكرة هي قوية إلى حد كبير غير المستغلة تكنولوجيا تعزيز قيمة هذا النظام النموذجي. على العكس من ذلك، فقد تم زراعة الخلايا تستخدم على نطاق واسع في دراسات البيولوجيا التطورية. ومع ذلك، فمن المهم تحديد ما إذا كان في المختبر الخلايا المستزرعة تمثل حقا في أنواع الخلايا الجسم الحي. تطعيم الخلايا في الأجنة، يعقبه تقييم مساهمتها خلال تطوير طريقة مفيدة لتحديد إمكانات في المختبر الخلايا المستزرعة. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة لترقيع الخلايا إلى موقع محدد من أجنة الفئران postimplantation الأولى، تليها الثقافة فيفو السابقين. كما نقدم طريقة Electroporation للالأمثل يستخدم الشعيرات الدموية كوب من القطر المعروف، مما يسمح للتوطين الدقيق وتعديل عدد الخلايا المستقبلة الحمض النووي الخارجية مع كل من عالية الكفاءة ترنسفكأيشن وموت الخلايا منخفضة. هذه التقنيات، والتي لا تتطلب أي ليرة سوريةمعدات ecialized، وتجعل التلاعب التجريبية لتكون المعيدة وأوائل مرحلة توالد جنين الفأر ممكن، مما يسمح للتحليل الالتزام في القطعان خلايا مستنبتة وتأثير التلاعب الجيني في الموقع على تمايز الخلايا.
Introduction
تم زراعة الخلايا المستخدمة على نطاق واسع في دراسات البيولوجيا التطورية. الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) والخلايا الجذعية الأديم الظاهر (EpiSCs) يمكن أن تفرق في جميع الطبقات الجرثومية الثلاث في المختبر، وتمثل نموذجا مفيدا للتمايز الخلايا في أوائل مرحلة التطور الجنيني الثدييات. وقد فتحت اشتقاق هذه خطوط الخلايا يصل فرصة للفي المختبر التلاعب وتحقيق مفصل للالمترجمة يشير الأحداث وشبكات النسخي تعمل في وقت مبكر خلال الزخرفة الجنينية. ومع ذلك، فإنه لا يزال من المهم تحديد أهميتها في الجسم الحي من أي تلاعب يؤديها في مجال الثقافة. وقد تم تقييم الإمكانيات في الجسم الحي من قبل الغرس المستمدة الجنين المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس عن طريق تعريفهم مرة أخرى إلى سابق للانغراس الأجنة (morulae أو الكيسات الأريمية) 1. ومع ذلك، يمكن EpiSCs التي تمثل خلايا الأديم الظاهر في الأجنة postimplantation لا تدمج بكفاءة في الأجنة سابق للانغراس 2،3. لدينا previoلنا النتائج أظهرت أن EpiSCs يمكن أن تولد بكفاءة الوهم والمساهمة في كل طبقات جرثومية، وعندما المطعمة إلى الأجنة postimplantation 4. وبالتالي، فإن أفضل طريقة لتقييم الخلايا المستزرعة في المختبر هي لتعريفهم بالبيئة يناظرها في الجسم الحي.
Electroporation للهو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لتقديم جزيئات الخارجية في الخلايا المستهدفة في كل المجراة في التجارب المختبرية. الطاقة الكهربائية يمكن أن يولد عدد كبير من المسام في غشاء الخلية، والذي يسمح حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين خارجي (DNA) الحمض النووي الريبي أو (RNA) من دخول الخلايا. واحدة من أكبر التحديات التي تواجه هذا الأسلوب هو الجمع بين بقاء الخلية الأمثل مع electrotransfection عالية الكفاءة 5،6. ل electroporation من الأحماض النووية في الأنسجة الجنينية، والأكثر شيوعا استخدمت أقطاب مطلية بالذهب، مما يسمح استهداف الخلايا في نطاق المكاني الواسع 7-9. لتحقيق المزيد من المحلىنقل الجينات lized، وقد استخدمت القطب على شكل إبرة لتحقيق الحقل الكهربائي البؤري 10،11. باستخدام هذه الطريقة، أظهرت الكتاب أنه بعد Electroporation لل، حوالي 30-60 الخلايا قد اتخذت حتى DNA بناء 11. ومع ذلك، يبدو أن ضبط بدقة عدد الخلايا electroporated يزال من الصعب مع القطب ذو عرض ثابت. وقد استخدمت هذه التقنية Electroporation للالشعرية لتقديم البلازميدات إلى الخلايا واحدة 12-14. ومع ذلك، لم يتم تطبيق هذه التقنية لelectroporating البلازميدات إلى الأجنة خارج الجسم الحي. وفي الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن microdevice لمحليا electroporate عدد قليل من الخلايا البعيدة الحشوية الأديم الباطن (أقل من 4 خلايا) في postimplantation مبكرة أجنة الفئران 15. ومع ذلك، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كان هذا الجهاز يمكن أن تستهدف بكفاءة الأديم الظاهر والأديم المتوسط خارج الحي.
في هذه الدراسة وصفنا طريقتين جديدة لتقييم وظيفة الخلوية والجينات في آخر في وقت مبكر-implantation الأجنة. علينا أن نبرهن أولا كيفية الكسب غير المشروع في المختبر الخلايا المستزرعة في مواقع محددة في أجنة الفئران في وقت مبكر لتقييم قدراتهم في الجسم الحي. دمج الخلايا المطعمة وأحفادهم، كل وصفت من قبل العلامة الوراثية (على سبيل المثال، وهو البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، يمكن فحص مزيدا من المناعية بروتينات معينة الأنسجة 4. ثانيا، نحن تصف طريقة محسنة لتقديم بالضبط DNA لمواقع محلية في جنين عبر Electroporation لل. وبدلا من استخدام القطب على شكل إبرة، ونحن إدخال سلك رفيع داخل غرامة ذات الرؤوس الزجاج الشعرية، وإثبات أن هذا التعديل يمكن أن يحقق الحمض النووي لعدد صغير من الخلايا مع كفاءة عالية ومحدودة خلية الموت. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أنه باستخدام الشعيرات الدموية الزجاج بأحجام مختلفة الافتتاح، نتمكن من السيطرة على عدد الخلايا electroporated. ولذلك، فإننا نعتقد أن هذا الأسلوب يمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة لدراسة مبكرة الزخرفة الجنينية التي تضم عدد قليل سخلايا F.
Protocol
Representative Results
Discussion
تطعيم النبات
في خطوة حاسمة لتجارب التطعيم الخلية ادراج سلسلة مترابطة من الخلايا في موقع مثالي في عمل واحد، لتجنب تفكك أجمة. وتتطلب هذه التقنية بعض الممارسات في السيطرة على ماصة الفم. إذا الخلايا المانحة تتضمن كذلك في البلد المضيف، ومشتقاتها تفريق في الجنين. لمزيد من تحديد ما إذا كان المتبرع فرقت الخلايا المشتقة من التفريق بشكل مناسب في البلد المضيف، المناعية يمكن أن يؤديها على أقسام الجنين. إذا الخلايا المانحة غير متوافقة مع البيئة المضيفة، لأنها إما لا يمكن الكشف عن (كما يتم طردهم من الجنين) أو تشكيل كتل غير مدمج في الأجنة بعد الثقافة. إذا لوحظت كل من الخلايا المتفرقة وكتل الخلايا، وهذا قد يشير إلى والمطعمة أن الكثير من الخلايا وأدى الخلايا المفرطة المانحة التي لا يمكن أن تتفاعل مع توضيح الخلايا المضيفة في تشكيل أجمة. في هذه الحالة، الطعوم إضافية تحتوي علىلا يمكن أن يؤديها عدد أقل من الخلايا.
القيد الرئيسي للتقنية تطعيم خلية هو أنه ليس من الممكن تحديد الإمكانات الكاملة في الجسم الحي من خلايا منذ الماوس الثقافة فيفو السابقين على مدى فترات لم يتحقق أطول من 48 ساعة. ومع ذلك، إذا جنبا إلى جنب مع حقن الخلايا الموجهة بالأمواج فوق الصوتية، قد يكون من الممكن نقل الخلايا المستزرعة إلى الأجنة في الرحم. لتلخيص، وقد استخدمت الخلية تطعيم التجارب على نطاق واسع في مجموعتنا وأعطت لنا ادلة قيمة حول إمكانية في الجسم الحي من مختلف أنواع الخلايا 4،21،22. وهو أسلوب المنفعة العامة لتقييم إمكانات في الجسم الحي في المختبر الخلايا المستزرعة في الأجنة postimplantation مبكرة.
Electroporation لل
على الرغم من أن في هذه الدراسة قمنا يظهر فقط أنه من الأفضل لاستخدام تقنية Electroporation للالشعرية لاستهداف الأديم الظاهر، طتي الممكن أيضا أن تستهدف عمدا طبقات جرثومية أخرى مثل خلايا الأديم. في خطوة حاسمة لتقنية Electroporation للالشعرية هو تقليل الوقت الذي يستغرقه لelectroporate كل جنين (<5 دقائق في الجنين) منذ PBS هو الأمثل للغاية لأجنة فئران في مراحلها المبكرة. بياناتنا أظهرت فوق ذلك، في معظم المناطق في الأجنة، Electroporation لللا يؤثر على نمو الجنين. ومع ذلك، Electroporation للفي عقدة تسبب نمو غير طبيعي وادت الى الوفاة المبكرة للجنين. هذا هو الأرجح بسبب تلف أو موت الخلايا التي تشكل مراكز إشارات هامة 23. وبالتالي، فإن هذه المنطقة لا بد من تجنبها مع هذه التقنية. A مزيد من التحذير هو أنه، على النحو المذكور في قسم النتائج، في حين استهدفت الأديم الظاهر أو خلايا متتالية بدائية، تم electroporated أيضا بعض خلايا الأديم. قد يكون هذا بسبب DNA يصل إلى الأديم الباطن من خلال الفجوات تحت الظهارة الأديم الظاهر. يتكون الأديم الباطن الخلايا الظهارية وتجربتنا عشرخلايا جنوب شرقي لديها الميل العالي لتولي DNA. ولذلك، عند تطبيق هذه التقنية لرسم الخرائط مصير، فمن المهم لتقييم الخلايا التي تتخذ في البداية حتى الحمض النووي.
كما تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من pCAG-GFP وpCAG-لجنة المساواة العرقية: البلازميدات GFP يمكن تقديمها بكفاءة باستخدام المعلمات Electroporation للهو مبين في هذه الدراسة، وكفاءة البنى DNA أخرى قد تختلف وتحتاج الأمثل الفردية. ويمكن إجراء تغييرات في تركيز الحمض النووي، Electroporation للجهد أو عدد النبضات إذا تم العثور على البلازميدات من الصعب ل transfect.
لتلخيص، يمكن أن لدينا الأمثل نظام Electroporation للالشعرية بكفاءة وبتكاثر تسليم GFP أو لجنة المساواة العرقية: البلازميدات GFP في عدد قليل جدا من الخلايا في الجنين مع موت الخلايا محدود. لأن هذا الأسلوب لا يتطلب معدات باهظة الثمن أو درجة عالية من التخصص، ويمكن ان تكون ذات فائدة كبيرة للدراسات تتبع الخلية أو في اختبار تأثير التعبير خارج الرحم أو الشرطي حذف سالجينات و الأجنة في وقت مبكر، ويتم تنفيذ إذا Electroporation للفي الأجنة التي تحمل floxed أليل متحولة المشروطة. لذلك، توفر هذه التقنية Electroporation للأداة وظيفية مفيدة لفهم على أساس خلية تلو خلية أدوار العوامل خلايا الجوهرية في سياق wildtype المترجمة بيئات الجنينية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council
Materials
| Forceps | Dumostar | T5390 | |
| Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
| Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
| Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
| Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
| 30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
| 4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
| tips | Greiner Bio One | 685280 | |
| Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
| Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
| Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
| Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
| Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
| Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
| Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
| Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
| A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
| pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
| pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
| Multimeter | Excel | XL830L | |
| Micromanipulators | Leitz | ||
| 0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
| Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
| Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
| A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |
References
- O’Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists. Pulmonary med. , 894063 (2012).
- Brons, I. G., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448, 191-195 (2007).
- Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448, 196-199 (2007).
- Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation. Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).
- Sadik, M. M., et al. Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation. Biophys. J. 106, 801-812 (2014).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).
- Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo. Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).
- Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation. JOP. 6, 128-135 (2005).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).
- Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation. Genesis. 35, 57-62 (2003).
- Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum. CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Nolkrantz, K., et al. Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary. Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).
- Mazari, E., et al. A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage. Development. 141, 2349-2359 (2014).
- Copp, A. J., Cockroft, D. L. . Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , (1990).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).
- Wilson, V., Beddington, R. S. Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak. Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis. Dev Cell. 17, 365-376 (2009).
- Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent. Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).
- Tsakiridis, A., et al. Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors. Development. 141, 1209-1221 (2014).
- Gouti, M., et al. In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity. PLoS biology. 12, e1001937 (2014).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120, 613-620 (1994).
