Генерация генетически модифицированных культур Органотипической кожи Использование нежизнеспособных Human дермы
Summary
The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Abstract
Органотипической культуры позволяют воссоздание 3D-среде критическим для контактных клетка-клетка и клетка-матрикс взаимодействий, которые имитирует функции и физиологию их в естественных условиях коллегами ткани. Это подтверждается органотипических культур кожи, которые верой и правдой повторяет дифференциации эпидермиса и стратификации программу. Первичные кератиноциты эпидермиса человека генетически манипулировать через ретровирусов, где гены могут быть легко сверхэкспрессированный или сбил. Эти генетически модифицированные кератиноциты могут быть использованы для восстановления эпидермиса человека в органотипических культур кожи, обеспечивающие мощную модель для изучения генетических путей, влияющих рост, дифференцировку эпидермиса и прогрессирование заболевания. Протоколы, представленные здесь, описывают способы получения девитальных человека дермы, а также генетически манипулировать первичных кератиноцитов человека для того, чтобы генерировать органотипической культур кожи. Регенерированный человеческую кожу можно использовать в downstrEAM приложений, таких как экспрессии генов профилирования, иммуноокрашивания и хроматина иммунопреципитации с последующим высокой пропускной секвенирования. Таким образом, поколение этих генетически модифицированных культур органотипических кожи позволит определить гены, которые имеют решающее значение для поддержания гомеостаза кожи.
Introduction
Эпидермис человека является многослойный эпителий, который подключается к подлежащей дерме через внеклеточный матрикс, известный как базальной мембраны эпидермиса zone.The не только служит в качестве непроницаемого барьера для предотвращения потери влаги, но и в качестве первой линии обороны, чтобы защитить Тело от иностранных и токсичных веществ 1. Базальный слой, который является глубокий слой эпидермиса, содержит эпидермальный стволовых и прогениторных клеток, которые приводят к дифференцированной потомство, которые образуют остальные эпидермиса 2. Как клетки-предшественники эпидермальные дифференциации они мигрируют наверх, чтобы сформировать первый слой дифференцированных клеток, известных как остистые слоя 3. В остистые слоя, клетки включить экспрессии кератинов 1 и 10, которые затем обеспечивают прочность, чтобы выдерживать физические нагрузки для дифференцированных слоев эпидермиса. Как остистые клетки слой дальнейшей дифференциации, они двигаются вверх в эпидермисе в течением зернистом слое, который характеризуется образованием кератогиалиновых и пластинчатых гранул, а также структурные белки, которые собраны ниже в плазматической мембране. Как клетки действовать в процессе дифференцировки в белки под плазматической мембраны поперечно связаны друг с другом в то время как пластинчатые гранулы экструдируют из клеток с образованием богатой липидами барьер под названием роговой слой 4.
Болезни, которые связаны изменения в росте и дифференциации эпидермиса воздействия ~ 20% населения 5. Таким образом, понимание механизмов этого процесса имеет большое значение. С проявлением многих из этих заболеваний является зависит от клетки к клетке или клеточной матрицы контакта, органотипической культуры, где эпидермис человека восстановленные в 3D-среде были созданы 6-10. Эти методы обычно включают использование первичных или трансформированных кератиноцитов, посеянных на внеклеточного матрикса, таких как нежизнеспособных человекадермы, Матригель или коллагена.
Чтобы понять генные регуляторные механизмы, которые важны в росте и дифференциации эпидермиса, кератиноциты может быть генетически манипулировать через ретровирусных векторов нокдаун или гиперэкспрессией генов в 2D культуре, а затем восстанавливали в 3D. Эти методы широко используются для характеристики гены, участвующие в эпидермиса стебля и клеток-предшественников самообновлению и дифференцировке, а также прогрессирования новообразования 11-21. Здесь протокол углубленной о том, как изменить экспрессию гена в эпидермальных органотипических культур за счет использования ретровирусов обеспечивается.
Protocol
Representative Results
Discussion
Генетические манипуляции в коже человека органотипической культуры предлагают много преимуществ обычно рассматривается 2D культивированных клеток, а также модели мыши. 2D культуры не имеют трехмерные клеточно-клетка и клетка-внеклеточный взаимодействия матрицы, найденной в интактны?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была supportedby Американское общество рака научных работников Грант (RSG-12-148-01-DDC) и биологии премии МКМР Basic (RB4-05779).
Materials
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
| DMEM | GIBCO | 11995 |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
| FBS | GIBCO | 10437-028 |
| Adenine | Sigma | A-9795 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
| Insulin | Sigma | I-1882 |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 |
| Transferrin | Sigma | T-0665 |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
| Matrigel | Corning | 354234 |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
| square pegs | Arts and crafts stores | |
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
| LZRS retroviral vector | Addgene | |
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one’s identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
