Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis
Summary
The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Abstract
Organotypischen Kulturen erlauben die Rekonstruktion eines 3D-Umgebung kritisch für Zell-Zell-Kontakt und Zell-Matrix-Wechselwirkungen, die die Funktion und Physiologie ihrer in vivo Gewebegegen nachahmt. Dies wird durch organotypische Hautkulturen, die treu rekapituliert die epidermale Differenzierung und Stratifizierung Programm veranschaulicht. Primären humanen epidermalen Keratinozyten sind genetisch manipulierbar durch Retroviren, wo Gene lassen sich überexprimiert oder abgerissen werden. Diese genetisch veränderte Keratinozyten kann dann verwendet werden, um die menschliche Epidermis in organotypischen Hautkulturen Bereitstellung einer leistungsfähiges Modell zu genetischen Signalwege zu untersuchen aufprall epidermalen Wachstums, Differenzierung und Fortschreiten der Krankheit zu regenerieren. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben Verfahren zur devitalized menschlichen Dermis vorzubereiten sowie genetisch zu manipulieren primären humanen Keratinozyten, um organotypischen Hautkulturen zu erzeugen. Regeneriert die menschliche Haut kann in downstr verwendet werdeneam Anwendungen wie Genexpressionsanalysen, Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation, gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung. So wird Generation dieser gentechnisch veränderten organotypischen Hautkulturen der Bestimmung von Genen, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Haut sind zu ermöglichen.
Introduction
Die menschliche Epidermis ist eine geschichtete Epithel, die zu der darunter liegenden Dermis durch eine extrazelluläre Matrix, wie die Basalmembran Zone Epidermis nicht nur als Barriere, um den Verlust von Feuchtigkeit zu verhindern, sondern auch als erste Verteidigungslinie, um die zu schützen dient bekannt verbindet Körper vor fremden und toxische Stoffe 1. Die basale Schicht, die der tiefsten Schicht der Epidermis ist, enthält die epidermalen Stammzellen und Vorläuferzellen, die zu dem differenzierten Nachkommen, die den Rest der Oberhaut 2 zu bilden ergeben. Der epidermale Stammzellen differenzieren sie sich nach oben zu wandern, um die erste Schicht von differenzierten Zellen wie spinosus Schicht 3 bekannt ist. Im Stratum spinosum, drehen Zellen auf die Expression der Keratine 1 und 10, die dann liefern die Kraft, körperliche Belastung für den differenzierten Schichten der Epidermis zu widerstehen. Da die Dornfortsätze Schicht-Zellen weiter zu differenzieren, nach oben in der Epidermis, um sie zu bewegenm die Körnerschicht, die durch die Bildung von Keratohyalin und lamellarem Granulate sowie Strukturproteine, die unterhalb der Plasmamembran montiert sind charakterisiert ist. Da die Zellen in dem Differenzierungsprozess fortzufahren, die Proteine unter der Plasmamembran sind Quer miteinander verbunden, während die plättchenförmigen Körnchen werden aus den Zellen extrudiert, um eine lipidreiche Barriere genannt Stratum corneum 4 bilden.
Erkrankungen, die Störungen der epidermalen Wachstums und der Differenzierung Schlag ~ 20% der Bevölkerung 5 einzubeziehen. Somit Verständnis der Mechanismen bei diesem Verfahren ist von großer Bedeutung. Da Manifestation viele dieser Krankheiten abhängig Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Kontakt haben organotypischen Kulturen, in denen die menschliche Epidermis in einer 3D Umgebung rekonstituiert 6-10 erstellt. Diese Verfahren beinhalten typischerweise die Verwendung von primären oder transformierte Keratinozyten auf der extrazellulären Matrix ausgesät wie devitalisierten menschlichenDermis, Matrigel oder Kollagen.
Gen-Regulationsmechanismen, die in den epidermalen Wachstums und der Differenzierung wichtig zu verstehen, können Keratinozyten genetisch durch retrovirale Vektoren manipuliert den Zuschlag oder überexprimieren Gene in 2D-Kultur und dann in 3D rekonstituiert. Diese Methoden sind sehr häufig benutzt worden, um Gene in epidermalen Stammzellen und Progenitorzellen Selbsterneuerung und Differenzierung sowie Progression Neoplasie 11-21 beteiligt charakterisieren. Hier eine eingehende Protokoll, wie die Genexpression in der Epidermis organotypischen Kulturen durch den Einsatz von Retroviren zu ändern ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genmanipulation in der menschlichen Haut organotypischen Kulturen bieten viele Vorteile häufig gelernten 2D kultivierten Zellen als auch Mausmodellen. 2D Kulturen fehlen die drei Zell-Zell und Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen dimensional in intakten Geweben und Organen gefunden. Jüngste Studien haben auch festgestellt, enorme Unterschiede zwischen 2D- und 3D-kultivierten Hautkrebszellen mit den 3D-kultivierten Zellen, die viel mehr Genexpression Ähnlichkeiten mit primären humanen Tumoren der Haut 16.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit war supportedby der American Cancer Society Forschung Gelehrte Grant (RSG-12-148-01-DDC) und dem CIRM Grund Biologie Award (RB4-05779).
Materials
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
| DMEM | GIBCO | 11995 |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
| FBS | GIBCO | 10437-028 |
| Adenine | Sigma | A-9795 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
| Insulin | Sigma | I-1882 |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 |
| Transferrin | Sigma | T-0665 |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
| Matrigel | Corning | 354234 |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
| square pegs | Arts and crafts stores | |
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
| LZRS retroviral vector | Addgene | |
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one’s identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
