Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain
Summary
The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Abstract
Cultures organotypiques permettent la reconstitution d'un environnement 3D critique pour les interactions de contact cellule-cellule et de cellule-matrice qui imite la fonction et la physiologie de leurs homologues in vivo de tissus. Ceci est illustré par des cultures organotypiques de peau qui récapitule fidèlement la différenciation épidermique et le programme de stratification. Kératinocytes primaires épidermiques humains sont génétiquement manipulable par rétrovirus où les gènes peuvent être facilement surexprimés ou renversé. Ces kératinocytes génétiquement modifiées peuvent ensuite être utilisés pour régénérer l'épiderme humain dans des cultures organotypiques de peau qui fournissent un modèle puissant pour étudier les voies génétiques croissance épidermique d'impact, la différenciation et la progression de la maladie. Les protocoles présentés ici décrivent des procédés pour préparer de derme humains dévitalisés ainsi que pour manipuler génétiquement les kératinocytes humains primaires afin de générer des cultures organotypiques de peau. La peau humaine régénéré peut être utilisé dans downstrEAM applications telles que le profilage de l'expression génique, une immunocoloration, des immunoprécipitations et de chromatine suivie de séquençage à haut débit. Ainsi, la production de ces cultures organotypiques de peau génétiquement modifiés permettra à la détermination des gènes qui sont essentiels pour le maintien de l'homéostasie de la peau.
Introduction
L'épiderme humain est un épithélium stratifié qui se connecte au derme sous-jacent à travers une matrice extracellulaire connu comme l'épiderme zone.The de la membrane basale sert non seulement une barrière imperméable pour empêcher la perte d'humidité, mais aussi en tant que première ligne de défense pour protéger le le corps des substances étrangères et toxiques 1. La couche de base, qui est la couche la plus profonde de l'épiderme, les cellules épidermique contient souches et progénitrices qui donnent lieu à la descendance différenciée qui forment le reste de l'épiderme 2. Comme les cellules progénitrices de l'épiderme se différencient de leur migration vers le haut pour former la première couche de cellules différenciées connu que la couche épineuse 3. Dans la couche épineuse, les cellules tournent sur l'expression de kératines 1 et 10, qui fournit alors la force de résister à une contrainte physique pour les couches différenciées de l'épiderme. Comme les cellules de la couche épineuses se différencient en outre, ils se déplacent vers le haut dans l'épiderme à dem la couche granulaire qui est caractérisée par la formation de granules de kératohyaline et lamellaires ainsi que des protéines de structure qui sont assemblés en dessous de la membrane plasmique. Comme les cellules passent dans le processus de différenciation, les protéines sous la membrane de plasma sont réticulés les uns aux autres, tandis que les granulés sont extrudés lamellaires à partir des cellules pour former une barrière lipidique riche appelée stratum corneum 4.
Les maladies qui impliquent des altérations de croissance épidermique et de l'impact de la différenciation de ~ 20% de la population 5. Ainsi, la compréhension des mécanismes de ce processus est d'une grande importance. Depuis manifestation de plusieurs de ces maladies est subordonnée à cellule-cellule ou cellule-matrice de contact, cultures organotypiques où l'épiderme humain est reconstitué dans un environnement 3D ont été créés 6-10. Ces procédés impliquent typiquement l'utilisation de kératinocytes primaires ou transformées ensemencées sur la matrice extracellulaire telles que les humains dévitalisésderme, Matrigel, le collagène ou.
Pour comprendre les mécanismes de régulation des gènes qui sont importants pour la croissance et la différenciation de l'épiderme, les kératinocytes peuvent être manipulées génétiquement par des vecteurs rétroviraux pour surexprimer des gènes knockdown ou en culture 2D et ensuite reconstitués en 3D. Ces méthodes ont été largement utilisées pour caractériser les gènes impliqués dans l'épiderme souches et cellules progénitrices auto-renouvellement et de différenciation ainsi que la progression de la néoplasie 11-21. Ici, un protocole en profondeur sur la façon de modifier l'expression génique dans des cultures organotypiques épidermiques par l'utilisation de retrovirus est fourni.
Protocol
Representative Results
Discussion
La manipulation génétique dans la peau humaine cultures organotypiques offrent de nombreux avantages à couramment étudié 2D cellules cultivées ainsi que des modèles de souris. Cultures 2D pas les trois dimensions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire interactions trouvés dans les tissus et organes intacts. Des études récentes ont également trouvé d'énormes différences entre les cellules de cancer de la peau en culture 2D et 3D avec les cellules cultivées en 3D montrant beaucoup plus de si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyée par la Société de recherche sur le cancer Scholars Grant américaine (RSG-12-148-01-DDC) et la biologie Award CIRM de base (RB4-05779).
Materials
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
| DMEM | GIBCO | 11995 |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
| FBS | GIBCO | 10437-028 |
| Adenine | Sigma | A-9795 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
| Insulin | Sigma | I-1882 |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 |
| Transferrin | Sigma | T-0665 |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
| Matrigel | Corning | 354234 |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
| square pegs | Arts and crafts stores | |
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
| LZRS retroviral vector | Addgene | |
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
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