Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis
Summary
The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Abstract
Organotypische kweken kan de reconstructie van een 3D-omgeving essentieel voor cel-cel contact en cel-matrix interacties die de functie en fysiologie van hun tegenhangers in vivo weefsel nabootst. Dit wordt geïllustreerd door organotypische huid culturen die trouw recapituleert de epidermale differentiatie en gelaagdheid programma. Primaire menselijke epidermale keratinocyten genetisch manipuleerbaar door middel van retrovirussen, waar genen gemakkelijk kan worden tot overexpressie gebracht of neergehaald. Deze genetisch gemodificeerde keratinocyten kan vervolgens worden toegepast om menselijke epidermis in organotypische kweken huid die een krachtige model te bestuderen genetische pathways beïnvloedende epidermale, differentiatie en ziekteprogressie regenereren. De hier gepresenteerde protocollen beschrijven werkwijzen voor devitalized menselijke dermis bereiden en genetisch manipuleren van primaire humane keratinocyten om organotypische kweken skin genereren. Geregenereerde menselijke huid kan worden gebruikt in stroomafwaartseeam toepassingen zoals genexpressie profiling, immunokleuring en chromatine immunoprecipitaties gevolgd door high throughput sequencing. Aldus zal genereren van deze genetisch gemodificeerde organotypische kweken skin de bepaling van genen die essentieel zijn voor het handhaven van homeostase huid mogelijk moeten maken.
Introduction
De menselijke epidermis is een gelaagd epitheel die aansluit op de onderliggende dermis door een extracellulaire matrix bekend als het basaal membraan zone.The epidermis niet alleen dient als een ondoordringbare barrière voor het verlies van vocht te voorkomen, maar ook als een eerste verdedigingslinie voor de bescherming lichaam van vreemde en giftige stoffen 1. De basale laag, die de diepste laag van de epidermis, bevat de epidermale stamcellen en progenitorcellen die tot de gedifferentieerde nageslacht dat de rest van de epidermis 2 te vormen. Epidermale stamcellen differentiëren ze migreren omhoog naar de eerste laag van gedifferentieerde cellen zogenaamde doornuitsteeksels laag 3 te vormen. In de doornuitsteeksels laag cellen zet de expressie van keratine 1 en 10, die vervolgens over een kracht om fysieke stress te weerstaan van de gedifferentieerde lagen van de epidermis. Aangezien de doornuitsteeksels laag cellen verder te differentiëren, zij omhoog bewegen in de epidermis voorm de granulaire laag die wordt gekenmerkt door de vorming van keratohyalin en lamellaire korrels en structurele eiwitten die onder de plasmamembraan worden geassembleerd. Aangezien de cellen doorgaan in het differentiatieproces, de eiwitten onder de plasmamembraan zijn verknoopt met elkaar, terwijl de lamellaire korrels geëxtrudeerd uit de cellen van een lipide rijke barrière genoemd stratum corneum 4 vormen.
Ziekten die veranderingen in epidermale differentiatie en effect ~ 20% van de bevolking 5 betrekken. Aldus begrip van de mechanismen van dit proces van groot belang. Omdat manifestatie van veel van deze ziekten is afhankelijk cel-cel- of cel-matrix contact zijn organotypische kweken waarbij de menselijke epidermis wordt gereconstitueerd in een 3D-omgeving gecreëerd 6-10. Deze methoden omvatten meestal het gebruik van primaire of getransformeerde keratinocyten gezaaid op extracellulaire matrix zoals gedevitaliseerde mensdermis, Matrigel of collageen.
Om gen regulerende mechanismen die belangrijk zijn in de epidermale en differentiatie zijn te begrijpen, kunnen keratinocyten genetisch gemanipuleerd worden door middel van retrovirale vectoren om knockdown of overexpressie van genen in 2D cultuur en vervolgens opnieuw in 3D. Deze methoden zijn uitgebreid gebruikt om genen betrokken bij epidermale stamcellen en cellen zelfvernieuwing en differentiatie alsmede progressie naar neoplasie 11-21 karakteriseren. Hier wordt een diepgaand protocol over genexpressie in de epidermis organotypische kweken veranderen door het gebruik van retrovirussen ontvangen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetische manipulatie in de menselijke huid organotypische kweken bieden vele voordelen vaak bestudeerd 2D-gekweekte cellen evenals muismodellen. 2D culturen missen de driedimensionale cel-cel en cel-extracellulaire matrix interacties in intacte weefsels en organen. Recente studies hebben ook gevonden enorme verschillen tussen 2D en 3D gekweekte huid kankercellen met de 3D-gekweekte cellen waaruit veel meer genexpressie gelijkenissen met primaire menselijke huidtumoren 16. Menselijke huid organotypische cult…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk was supportedby de American Cancer Society Research Geleerden Grant (RSG-12-148-01-DDC) en de CIRM Basic Biologie Award (RB4-05779).
Materials
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
| DMEM | GIBCO | 11995 |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
| FBS | GIBCO | 10437-028 |
| Adenine | Sigma | A-9795 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
| Insulin | Sigma | I-1882 |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 |
| Transferrin | Sigma | T-0665 |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
| Matrigel | Corning | 354234 |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
| square pegs | Arts and crafts stores | |
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
| LZRS retroviral vector | Addgene | |
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one’s identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
