جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان
Summary
The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Abstract
الثقافات عضوي النمط تسمح إعادة تشكيل بيئة 3D الحرجة للاتصال خلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات التي يحاكي وظيفة وظائف أعضاء في الجسم الحي نظرائهم الأنسجة. ويتمثل ذلك من خلال الجلد الثقافات عضوي النمط الذي يلخص بأمانة التمايز البشرة وبرنامج الطبقية. الكيراتينية البشرة الإنسان الأساسية هي للتلاعب وراثيا من خلال الفيروسات القهقرية حيث الجينات يمكن overexpressed بسهولة أو طرقت إلى أسفل. ويمكن بعد هذه الخلايا الكيراتينية المعدلة وراثيا يمكن استخدامها لتجديد البشرة الإنسان في الثقافات الجلد عضوي النمط تقديم نموذج قوي لدراسة مسارات الوراثية نمو الارتطام البشرة، والتمايز، وتطور المرض. البروتوكولات المعروضة هنا تصف أساليب لإعداد الأدمة البشرية الميتة فضلا عن التلاعب وراثيا الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية من أجل توليد الثقافات الجلد عضوي النمط. جلد الإنسان مجدد يمكن استخدامها في downstrتطبيقات زير الشئون الخارجية مثل التنميط التعبير الجيني، المناعية، وimmunoprecipitations لونين تليها عالية الإنتاجية التسلسل. وهكذا، فإن جيل من هذه الثقافات الجلد عضوي النمط المعدلة وراثيا تسمح تحديد الجينات التي تعتبر بالغة الأهمية للحفاظ على توازن البشرة.
Introduction
البشرة الإنسان هو ظهارة طبقية الذي يصل إلى الأدمة الكامنة من خلال المصفوفة خارج الخلية يعرف باسم الغشاء القاعدي البشرة zone.The يخدم ليس فقط بمثابة حاجز كتيمة لمنع فقدان الرطوبة ولكن أيضا باعتبارها خط الدفاع الأول لحماية الجسم من المواد الغريبة والسامة 1. الطبقة القاعدية، وهو أعمق طبقة من البشرة، ويحتوي على الخلايا الجذعية البشرة والسلف التي تؤدي إلى ذرية المتباينة التي تشكل بقية البشرة 2. كما الخلايا الاصلية البشرة تفرق تهاجر صعودا لتشكيل الطبقة الأولى من الخلايا المتمايزة المعروفة باسم طبقة الشائكة 3. في الطبقة الشائكة، والخلايا تتحول على التعبير عن keratins 1 و 10، والذي ثم توفير القوة لتحمل الإجهاد البدني للطبقات متباينة من البشرة. كما خلايا الطبقة الشائكة مزيد من التمييز، وأنها تتحرك صعودا في البشرة للم الطبقة الحبيبية التي تتميز تشكيل كيراتوهيالينية ورقائقي حبيبات وكذلك البروتينات الهيكلية التي يتم تجميعها تحت غشاء البلازما. كما الخلايا المضي قدما في عملية التمايز، والبروتينات تحت غشاء البلازما عبر ربطها بعضها البعض في حين تنبثق حبيبات رقائقي من الخلايا لتشكيل الدهون يسمى حاجز الغنية الطبقة القرنية 4.
الأمراض التي تنطوي على تغييرات في نمو البشرة وأثر التمايز ~ 20٪ من السكان 5. وبالتالي، فهم آليات هذه العملية هو من أهمية كبيرة. منذ مظهر من مظاهر العديد من هذه الأمراض يتوقف على خلية خلية أو خلايا مصفوفة الاتصال والثقافات عضوي النمط حيث يتم إعادة تشكيل البشرة الإنسان في بيئة 3D تم إنشاء 10/06. هذه الطرق تشمل عادة استخدام الخلايا الكيراتينية الأولية أو تحويلها المصنف على المصفوفة خارج الخلية مثل الإنسان مماتالأدمة، Matrigel، أو الكولاجين.
لفهم الآليات التنظيمية الجينات التي تعتبر مهمة في نمو البشرة والتمايز، الخلايا الكيراتينية يمكن التلاعب بها وراثيا من خلال ناقلات فيروسات لضربة قاضية أو بإفراط عن الجينات في الثقافة 2D ثم إعادة تشكيل في 3D. وقد استخدمت هذه الأساليب على نطاق واسع لوصف الجينات المسؤولة عن الجذعية البشرة والخلايا الاصلية تجديد الذات والتمايز، وكذلك التقدم إلى الأورام 11-21. هنا، يتم توفير بروتوكول معمقة حول كيفية تغيير التعبير الجيني في الثقافات عضوي النمط البشرة من خلال استخدام الفيروسات القهقرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التلاعب الجيني في جلد الإنسان الثقافات عضوي النمط توفر العديد من المزايا لدرس عادة 2D الخلايا المستزرعة وكذلك نماذج الماوس. ثقافات 2D تفتقر إلى خلية خلية وخلية الخلية التفاعلات مصفوفة ثلاثية الأبعاد الموجودة في الأنسجة والأعضاء السليمة. وقد وجدت الدراسات الحديثة أيض…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل supportedby الأمريكية سرطان جمعية أبحاث علماء جرانت (RSG-12-148-01-DDC) وجائزة البيولوجيا CIRM الأساسية (RB4-05779).
Materials
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
| DMEM | GIBCO | 11995 |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
| FBS | GIBCO | 10437-028 |
| Adenine | Sigma | A-9795 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
| Insulin | Sigma | I-1882 |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 |
| Transferrin | Sigma | T-0665 |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
| Matrigel | Corning | 354234 |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
| square pegs | Arts and crafts stores | |
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
| LZRS retroviral vector | Addgene | |
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one’s identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
