Um método geral para avaliar os efeitos Estimulação Profunda do Cérebro em metanfetamina intravenosa auto-administração

Todos os procedimentos são aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o LSUHSC Institucional e foram realizadas de acordo com o NIH "Princípios de cuidados com os animais de laboratório." 1. Rodent Aclimatação e Alimentação Restrição Utilizar ratos Wistar adultos que são 3 meses de idade no inicio da experiência. Casa ratos individualmente em gaiolas equipadas com uma unidade de fluxo laminar e filtro de ar, uma instalação de cuidados animais AAALAC credenciados temperatura e umidade controladas em um ciclo claro / escuro invertido luz de 12 horas (luzes apagadas em 0600 hr). Fornecer água e ração padrão para roedores livremente até pesos corporais são aproximadamente 380-400 g. Subsequentemente, alimentos-restringir ratos e mantida a 85 a 90% dos seus pesos corporais com alimentação livre durante as sessões experimentais, para facilitar a aquisição e manutenção de resposta à metanfetamina. Lidar com roedores na sala de gaiola diariamente desde a chegada em todo o experimentalsessões, a fim de registrar o peso corporal e ajustar a alocação de alimento diário. Uma vez pesos-alvo são alcançados, se preparam para implantar cirurgicamente cada rato com um cateter jugular residente crônica e eletrodos estimulantes intracranianos. 2. Jugular Vein Cateterismo Cateter Preparação Preparar um comprimento de 13 cm de tubo silástico com um diâmetro interno de 0,012 x 0,025 ", criar uma esfera de silicone 4 cm de uma das extremidades do tubo utilizando tubagem de silicone extra e electrocauterização, e deixar secar ao ar. Mergulhar a outra extremidade do tubo em um solvente à base de limoneno derivada de citrinos durante alguns minutos e deixa-se expandir. Conecte o tubo expandido para uma guia de aço inoxidável cânula dobrado em um ângulo direito. Ancorar a base dobrada da guia de aço inoxidável cânula a uma "praça de malha biocompatível utilizando cimento acrílico dental 1. Lave o cateter dentro e por fora com etanol e wate destiladar. Injectar ar através do tubo para eliminar as gotículas de líquido residual. Deixar secar S / N. Técnica estéril Executar todas as cirurgias em um animal centro cirúrgico dedicado utilizando técnicas cirúrgicas assépticas. Esterilizar instrumentos e implantes utilizando uma autoclave e preparar uma área estéril, colocando papel impermeável sobre a mesa ou cobertas com uma toalha estéril (s). Usar luvas estéreis e manter todos os instrumentos, implantes e gaze cirúrgica na área estéril durante o procedimento. Limpe cada instrumento com uma compressa com álcool seguido de 20 segundos em um esterilizador talão entre os procedimentos quando várias cirurgias são realizadas. Anestesia Pretreat ratos com atropina (sulfato) (0,04 mg / kg, SQ) seguida por pentobarbital (20 – 50 mg / kg, ip) para atingir a anestesia. Injectar animais com suspensão estéril penicilina G procaína (75.000 unidades, IM) e um agente analgésico (carprofeno, 5 – 10 mg / kg, sc ou KEToprofen, 2 – 5 mg / kg, sc) imediatamente antes da cirurgia para diminuir perioperatório infecções e dor, respectivamente. Verifique para anestesia adequada, oferecendo uma pitada dedo do pé moderada para o animal e, se não houver resposta, então prossiga. Aplique lubrificante olho em ambos os olhos. Preparação de local cirúrgico Raspar um remendo cm 2 x 2 dorsal nas costas do rato imediatamente posterior a uma linha que liga as omoplatas. Raspar um patch 1 x 1 cm ventral na região do pescoço à direita entre o osso da mandíbula e do esterno. Limpe as áreas raspadas com compressas embebidas em álcool, seguido por solução de betadine. Coloque rato sobre uma toalha estéril e permitir que o betadine para secar antes de prosseguir. Implantação do Cateter Realizar uma incisão paralela a uma linha que liga as omoplatas na região midscapular na parte de trás utilizando uma faca de lâmina 10. Utilize uma pinça hemostática para separar a pele a partir do tecido conjuntivo subjacente para criar um plano para omalha base de cateter. Irrigar a área com soro fisiológico estéril e cobrir com gaze estéril antes de ligar o rato sobre suas costas. Faça uma incisão diagonal entre o osso da mandíbula direita eo esterno usando uma faca de 10 blades. Utilize uma pinça hemostática para separar a pele a partir do tecido conjuntivo subjacente para localizar a veia jugular. Nota: A veia jugular aparece em branco / prata e brilhante e é maior em ratos machos do que nas fêmeas. Coloque uma espátula debaixo da veia, amarrar uma sutura de seda 4-0 suavemente ao redor da parte superior (parte proximal) da veia exposta e empurrar a veia de volta para o pescoço. Separa-se os tecidos conjuntivos para criar uma bolsa superficial sob a pele no pescoço inferolateral mas acima do músculo. Empurre a trocar esterilizado da incisão pescoço à incisão midscapular por tunelamento para trás do braço para cima. Executar o cateter da parte de trás para o pescoço, inserindo-se um fio de guia através do trocarte rígido a partir da extremidade do pescoço e no cateter distal. Puxe afio-guia de volta através da incisão no pescoço e distal do cateter ligado se seguirão. Isolar a veia jugular direita sobre uma espátula, puxando para cima na sutura proximal previamente colocado. Use uma tesoura bola para fazer um pequeno corte parcial no lado superior da veia. Insira uma pinça curva na incisão da veia para abri-lo. Mantendo a pinça separados, mas no lugar, passar a ponta do cateter entre as pontas pinça e na veia cerca de 2 – 3 cm, onde a mesma termina no exterior do átrio direito. Prenda o cateter por amarrar uma sutura de seda 4-0 em torno da veia distal. Amarre a suturas proximal e distal junto em uma "caixa" nó para adicionar estabilidade extra. Lave cateter com solução salina estéril heparinizado e recuar de sangue para confirmar o sucesso da implantação. Apare as suturas 1 – 2 mm acima dos nós e dobra do cateter proximal remanescente sob a pele do pescoço. Termino com uma sutura / método apropriado de sua escolha. Se não-unidade de absorvânciaBable suturas ou agrafos são usados, eles devem ser removidos em 10-14 dias sob anestesia geral. Cubra incisão com pomada antibiótica usando um aplicador de ponta de algodão estéril. Ancorar a montagem de cateter / cânula guia / malha distal de volta para o tecido subcutâneo usando suturas absorvíveis em dois dos cantos opostos da base de malha. Feche a incisão de volta ao redor da cânula guia usando interrompidos, suturas absorvíveis não invertida. Cubra incisão com pomada antibiótica usando um aplicador de ponta de algodão estéril. Cuidados pós-operatório Limpar o cateter com soro fisiológico estéril heparinizado solução a 0,9%, utilizando uma seringa de 3 ml e colocar um obturador para dentro da guia de uma cânula para evitar o entupimento. Lave cateter de cada um dos ratos numa base diária para manter a desobstrução. Imediatamente após o procedimento, coloque o rato em sua gaiola sobre uma almofada de aquecimento na sala de cirurgia e observar até que a consciência ea de regresso movimento espontâneo. Retorne o rato recuperado para a sala de colônia e permitir que cinco a sete dias para passar antes da cirurgia intracraniana. Pesar, punho, e avaliar a sua condição geral diária, incluindo a verificação de infecção e avaliar os níveis de comportamento animal, de aparência e de atividade. Consulte o veterinário Recursos Animais no caso de surgirem quaisquer problemas e acompanhar quaisquer regimes de tratamento recomendados. Injectar animais com um agente analgésico (carprofeno, 5 – 10 mg / kg, sc ou cetoprofeno, 2 – 5 mg / kg, sc) no tratamento da dor perioperatória, conforme necessário. 3. intracraniana Colocação de eletrodos Preparação cirúrgica Executar todas as cirurgias em condições estéreis, como descrito na seção 2.2. Anestesia Coloque animal numa câmara de indução de anestesia e isoflurance fornecer o fluxo de gás para dentro da câmara a 1.000 – 2.000 ml / min com o vaporizador de 5%. Uma vez que animal é reclinada, retire da câmara umnd colocar no nariz cone na plataforma operacional estereotáxica acolchoada. Alternar o fluxo de gás da câmara de nariz cone e executar a gás com vaporizador fixado em 2-3%. Ajuste do vaporizador conforme necessário para manter a respiração estáveis ​​e sem resposta à estimulação durante a cirurgia. Injectar rato com penicilina G procaína suspensão estéril (75.000 unidades, im) e de um agente analgésico (buprenorfina 0,05 a 0,5 mg / kg sc) imediatamente antes da cirurgia para diminuir perioperatório infecções e dor, respectivamente. Verifique para anestesia adequada, oferecendo uma pitada dedo do pé moderada para o animal e, se não houver resposta, então prossiga. Aplique lubrificante olho em ambos os olhos. Preparação de local cirúrgico Raspar o topo da cabeça do rato e coloque o rato em barras de ouvido para manter sua cabeça imóvel durante o procedimento. Limpe a área raspada com compressas embebidas em álcool, seguido por solução de betadine. Permitir que o betadine para secar antes de prosseguir. Eletrodo Implantação Segure o couro cabeludo entre e ligeiramente anterior para os ouvidos com uma pinça e usar uma tesoura para cortar em toda a base. Este manuveur irá remover uma área de 1,5 x 1 cm de pele sobre o mid-crânio. Use uma lâmina 10 para fazer uma incisão circunferencial através do pericrânio até o crânio e um fórceps curvos para raspar e remover o pericrânio. Lavar a área com solução salina estéril, dab o excesso de sangue e soro fisiológico com uma gaze, e permitir que o crânio até secar completamente para os pontos ósseos, incluindo a bregma, pode ser claramente visto. Para a cirurgia bilateral, montar dois eletrodos de platina-irídio bipolares, um em cada suporte do eletrodo de cada lado da plataforma operacional estereotáxica. Mova o primeiro eletrodo na posição ~ 1 mm por cima do bregma e anote as coordenadas estereotáxicas para o ântero-posterior (AP) e (ML) posições, que serão mostradas no display digital médio-lateral. NÃO realmente tocar a ponta do eletrodo para o skull porque o eletrodo deixarão de função. Repita este procedimento para o outro eletrodo. Calcular o AP final e ML coordenadas baseado na estrutura alvo de interesse. Mova o eletrodo para esta posição com a ponta logo acima do crânio para obter o inicial dorsoventral (DV) de coordenadas no visor digital. Calcula-se a profundidade DV final com base na estrutura alvo de interesse. Nota: O núcleo accumbens foi alvo, neste exemplo, dado o seu envolvimento no comportamento conhecido-droga consumatória 8 usando o seguinte coordenadas estereotáxicas relativamente à bregma: AP entrada coordenar = [exibido Digital coordenar a bregma] + 1.6 Entrada ML coordenada = [exibido Digital coordenar a bregma] ± 2,4 para a direita / esquerda Profundidade DV = [exibido Digital coordenar a superfície do crânio na entrada AP / ML] – 8,5 Marque a posição de entrada projetada de cada eletrodo na superfície do crânio com um ma permanenterker. Não bata ou tocar a ponta do eletrodo durante esta manobra. Use um diamante bola burr revestido rodada para perfurar um buraco 1,4 milímetros em cada marca. Tenha cuidado para não mergulhar através do crânio para o cofre intracraniana com a broca de alta velocidade. Use uma pinça curva para perfurar a dura uma vez que o crânio foi perfurado distância. Use um diamante revestido burr bola redonda para perfurar buracos 0,7 mm em mais quatro locais por trás das entradas de eléctrodos para a colocação de parafusos crânio. Utilize uma chave manual para colocar quatro 0,8 (diâmetro) x 3,2 parafusos de aço inoxidável (comprimento) mm no crânio, dois de cada lado da linha média. Firmemente assegurar esses parafusos até cerca de metade do seu comprimento no crânio, porque eles são a principal infra-estrutura que irá realizar a calota craniana em vigor para as próximas semanas e meses. Cuidadosamente inserir o primeiro eléctrodo através do seu burrhole no cérebro para a profundidade calculada DV rodando manualmente o botão que gere a coordenada Z deo porta-eletrodo. Rode o botão em uma taxa aproximadamente igual a 1/2 de volta por segundo para evitar danos indevidos à ponta do eletrodo. Certifique-se a ponta do eletrodo não tocar na borda óssea do burrhole ao entrar no cérebro. Prenda o primeiro eletrodo usando super-cola em camadas sobre o burrhole e os parafusos posteriores, seguido de cimento dental. Uma vez que esta construção secou completamente, retire o eletrodo do seu titular. Repetir o processo de inserção e cimentação para o segundo eléctrodo. Aplique o cimento dental direito até a borda da pele, mas não se sobrepõem com a pele, porque isso solta a craniano tampa de cimento a longo prazo. Cuidados pós-operatório Coloque dois tampões nos pedestais de eletrodos para evitar o entupimento. Imediatamente após o procedimento, coloque o rato em sua gaiola sobre uma almofada de aquecimento na sala de cirurgia e observar até que a consciência ea de regresso movimento espontâneo. Retorne o rato recuperado para the sala de colônia e permitir cinco dias para passar antes do início do experimento. Pesar, punho, e avaliar o estado geral dos ratos diariamente, incluindo a verificação de infecção e avaliar os níveis de comportamento animal, de aparência e de atividade. Consulte o veterinário Recursos Animais no caso de surgirem quaisquer problemas e acompanhar quaisquer regimes de tratamento recomendados. Injectar animais com um agente analgésico (buprenorfina 0,05 a 1 mg / kg SC) para tratar a dor perioperatória, conforme necessário. Hemorragia intracraniana pode ser mais prevalente com o uso de medicamentos analgésicos não-esteroidais (carprofeno, 5 – 10 mg / kg, sc ou cetoprofeno, 2 – 5 mg / kg, sc) para usar no período perioperatório buprenorfina para a cirurgia intracraniana. 4. Aparelho Operant Use plástico e aço inoxidável câmaras de condicionamento operante contido no interior de caixas de atenuação de som para executar os experimentos comportamentais. Equipar cada gabinete com um exaustor para fornecer ventilação e branco noiSE para mascarar sons exteriores. Use um computador pessoal e um sistema de interface de software comportamental para programar os procedimentos e recolher os dados experimentais. Geral Set-Up Equipar cada câmara experimental com duas alavancas de resposta montado numa parede da câmara de luz com um estímulo localizado por cima de cada alavanca. Designar uma das alavancas a alavanca de "ativo" de forma que resulte em conseqüência programada quando pressionado. Programar uma luz estímulo localizado diretamente acima da alavanca de resposta ativa para iluminar durante cada sessão operante, indicando a disponibilidade de drogas. Ter uma resposta sobre o resultado alavanca ativa em uma entrega de infusão de metanfetamina (0,05 mg / kg / infusão em 100 mL de NaCl 0,9%) mais de 2,8 seg acompanhada pela luz casa na parede oposta vai ON por 5 segundos ea luz estímulo vai OFF para a 30-sec timeout. Contagem de respostas na alavanca ativa, mas eles não devem ter conse programadaconse- durante o período de tempo limite de 30 segundos. Para a conclusão, as respostas recordes na alavanca inactiva, mas que não deverá ter consequências programadas. 5. intravenosa (IV) Metanfetamina auto-administração Procedimento Preparativos Gerais Ratos de carga nas câmaras operantes tão rapidamente e calmamente possível para minimizar artefatos comportamentais. Anexar uma coleira inoxidável mola de aço para a cânula guia nas costas do roedor e um giro à prova de vazamentos de fluido suspenso acima da câmara operante. Assegurar a integridade do tubo de ligação da peça giratória da seringa 20 ml de droga em uma bomba accionada por um motor localizado no exterior da caixa de atenuação de som. Para fazer isso, empurre a mangueira de ligação de plástico, pelo menos ¼ de polegada para a ponta de metal giratória e a agulha ponta da seringa droga até que não vai escorregar com puxando moderada. Contrabalançar a montagem giratória e trela para permitir m relativamente irrestritaovement do animal. Realizar sessões operantes aproximadamente à mesma hora todos os dias de segunda a sexta-feira. Aquisição A fim de facilitar a aquisição rápida de IV metanfetamina auto-administração, os ratos são executados em sessões diárias de 6 h durante quatro a cinco dias consecutivos. Conduzir essas sessões em uma proporção fixa FR-1 + 30 sec cronograma de reinforcementduring que os ratos recebem uma infusão de IV metanfetamina para cada imprensa na alavanca ativa seguido por um 30 seg time-out (por exemplo, nenhuma sugestão ou recompensar consequências ocorrer com pressionando de qualquer das alavancas). Nota: Este acesso inicial e prolongada "fácil" irá resultar na maior parte dos roedores que adquirem droga significativa tendo comportamento em menos do que ou igual a uma semana (Figura 3). Manutenção Durante a segunda semana de treinamento, os ratos são executados em sessões diárias de 2 h de segunda a sexta-feira para manter e aperfeiçoar IV Methamphetamine auto-administração. Sessões de conduta em uma proporção fixa FR-1 + 30 sec cronograma tempo limite de reforço. Documento estável, intensa resposta quando o número total de apresentações metanfetamina ao longo de cada sessão varia menos de 10% para três sessões consecutivas (Figura 4) e o número acumulado de infusões entre o primeiro 30-min seja maior do que o número cumulativo de infusões durante o segundo 30 min (Figura 5). Nota: Este critério garante que os ratos desenvolvem um padrão de carregamento de droga no início da sessão que indica um comportamento viciante 19 e uso não apenas ocasional. Pós-sessão No fim de cada sessão, desligar a trela das costas do roedor. Lave o cateter com 0,1 ml de solução salina 0,9% contendo 800 UI de estreptoquinase para prevenir coágulos sanguíneos. Insira um obturador para cada cânula guia para evitar o entupimento antes de voltar a rats aos gaiolas. Teste a permeabilidade dos cateteres imediatamente após o fim de cada sessão experimental nas quartas-feiras ao longo do curso do experimento. Prepara-se uma seringa de 3 cc, com uma agulha G 22, que contém solução salina heparinizada bacteriostática para testar a permeabilidade do cateter. Conecte uma extremidade de um longo pedaço de 4 a 6 polegadas de tubos de plástico para a agulha ea outra extremidade para o cargo de metal do conjunto de cateter-cânula no dorso do animal. Infundir 0,1 a 0,2 ml de solução salina para assegurar um fluxo clara e, em seguida, extrair o êmbolo da seringa para trás. Se o cateter é patente, que deveria tanto nivelada com facilidade e chamar de volta o sangue que será visível na tubulação. Solte o êmbolo e infundir mais 0,2 ml para lavar todo o sangue de volta através do cateter. Se o sangue não pode ser retirado, em seguida, retire a seringa de 3 cc e tubulação do posto de metal. Prepara-se uma seringa de 1 cc, com uma agulha G 22, contendo meto-hexital de sódio, um fast-actinganestésico, a uma maior permeabilidade do cateter de teste. Conecte uma extremidade de um longo pedaço de 4 a 6 polegadas de tubos de plástico para a agulha ea outra extremidade para o cargo de metal do conjunto de cateter-cânula no dorso do animal. Infundir 1,5 mg e rapidamente remover a seringa de 1 cc e tubulação do poste de metal nas costas do animal. Volte a ligar a seringa de 3 cc preenchido com solução salina bacteriostática heparinizado e infundir 0,1 – 0,2 ml. Se o animal perde tónus muscular dentro de 3 segundos, em seguida, o cateter é patente e funcional. Consulte o arquivo suplementar "armadilhas comuns" armadilhas para uma seção que aborda reações adversas a metanfetamina, a não aquisição metanfetamina auto-administração, e extração de rato dificuldade. 6. Estimulação Cerebral Aparelho Use de 10 a 12 caixas de plexi-vidro (12 x 18 x 18 em) (LxAxP) para executar os experimentos DBS. Cubra cada caixa do lado de fora com opaca durapapel que cobre a parte traseira e os lados da caixa para evitar que os ratos de visualização ou interagindo uns com os outros. Deixe o painel frontal transparente descoberto de modo que o examinador possa ver os animais durante as sessões de estimulação. Cobrir os topos das caixas com um painel semi-permeável que impede que os ratos de escapar enquanto permite o fluxo de ar. Utilize este painel para apoiar os comutadores que estão localizados acima de cada caixa para facilitar a conexão elétrica entre a tampa da cabeça de roedores e do sistema de estimulação. Use um sistema de estimulação que pode fornecer corrente constante para vários animais simultâneas para os experimentos DBS. Use um sistema que consiste em uma interface de processador de sinal digital programável pelo usuário / comunicações, um estimulador, uma bateria estimulador, uma caixa de canal de divisão, eo software que o acompanha (Veja Materiais Folha). Utilize cabos costume de comprimento para conectar portos do canal do estimulador para o pedestal eletrônico superior de cada commutatou. Nota: O comprimento necessário dependerá do laboratório individual. Estes cabos estão fora da área do animal e não precisam de ser cobertas em mola de aço inoxidável. Conecte o pedestal eletrônico inferior do comutador para o pedestal eletrodo implantado na tampa da cabeça do roedor usando 16-in cabos cobertos com mola de aço inoxidável. Verifique se os cabos são longos o suficiente para permitir a livre circulação de todas as áreas do recinto sem tensão significativa na tampa da cabeça. Nota: Um cabo que termina mais ou menos onde a cabeça do rato seria quando de pé sobre as quatro patas é geralmente adequada. Programação Brain Stimulation Use um computador e software de programação pessoal para programar os parâmetros de estimulação (por exemplo, forma de onda, freqüência, largura de pulso, atraso inter-estímulo, amplitude atual) e coletar os dados experimentais. Usando uma linguagem de programação visual, especificar quais funções cada dispositivo irá realizar para satisfazer as expeendpoints mentais e quais dados serão armazenados e / ou projetada para visualização em tempo real. Os comandos que são executados este projeto em particular está demonstrado na Figura 1. Especificar a frequência desejada, largura de impulso, e a amplitude para o painel de controlo visual (Figura 2) antes do início da experiência. Parâmetros típicos para a estimulação de alta frequência em ratos são semelhantes aos utilizados na clínica estimulação cerebral profunda humano: frequência de 130 Hz to180, largura de pulso de 60 a 90 ms, e da amplitude da corrente de 100 a 250 uA 4,8-10. Nota: Uma corrente inferior é usado no roedor, devido ao seu tamanho reduzido em comparação com o primata. 7. Estimulação Cerebral Profunda Procedimento Para carregar ratos nas caixas, conecte o cabo mola de aço inoxidável do comutador a cada pedestal eletrodo na tampa da cabeça. Teste a impedância de cada eléctrodo, executando 5 mA de corrente a uma frequênciade 1.000 Hz por 2 s. Se a impedância é igual ou inferior a 125 KOhm, em seguida, proceder com a experiência, porque o eléctrodo é capaz de proporcionar a estimulação terapêutica. Se a impedância é superior a 125 KOhm, considerar a remoção do animal a partir do experimento de alta porque a resistência do eléctrodo pode truncar a corrente para níveis potencialmente sub-terapêuticos. Execute os ratos através de uma ou duas sessões simuladas para habituação durante a qual serão anexados ao cabo do eletrodo (s) mas não recebendo qualquer terapia ativa. Teste simulada eliminar quaisquer efeitos comportamentais não-específicos. Imediatamente após cada sessão simulada, transportar os ratos para as caixas de operantes para o diário sessões de 2 horas de IV metanfetamina auto-administração. Contrabalançar os ratos em dois grupos, um-estimulação ativa e uma coorte sham-estimulação para que o consumo de droga de linha de base não é significativamente diferente entre os grupos. Execute sessão diária DBSs na coorte roedor por 5 dias durante o qual eles recebem qualquer estimulação elétrica do cérebro ativo ou sem estimulação durante 3 horas, dependendo do seu trabalho de grupo. Imediatamente após cada sessão DBS, ratos de transporte para as caixas de operantes para o diário sessões de 2 horas de IV metanfetamina auto-administração. Observe os animais cuidadosamente durante pelo menos uma parte de cada sessão DBS para certificar-se o estímulo não está causando alterações claras em comportamento animal. Se quaisquer comportamentos anormais durante / após a estimulação, ter o cuidado de documentar essas observações. Nota: Os autores não tenha notado alterações comportamentais ou alterações significativas na ingestão de alimentos / água durante o experimento descrito neste artigo. Alterar a duração do tratamento DBS, os parâmetros eléctricos, e o tempo entre a sessão de DBS e a sessão operante, conforme necessário, dependendo da hipótese.