静脈内メタンフェタミン自己管理に脳深部刺激効果を評価するための一般的な方法

すべての手順はLSUHSC機関動物実験委員会によって承認され、NIHに従って実施された「実験動物のケアの原則。 " 1.齧歯類順化と食事制限実験の開始時に3ヶ月の古い大人のウィスターラットを使用してください。逆の12時間の明/暗サイクル（0600時間で消灯）の温度と湿度が管理され、AAALAC公認の動物ケア施設における層流ユニットおよびエアフィルターを装備したケージで単独ハウスラット。 400グラム – 体重が約380になるまで、自由に水およびげっ歯類用の標準食を提供します。その後、ラットを食物制限し、メタンフェタミンへの応答の獲得と維持を容易にするために、実験的なセッション中に、フリー送り体重の85〜90％で維持します。 実験を通して到着から毎日ホームケージルームでげっ歯類の取り扱い体重を記録し、毎日の食物配分を調整するためにセッション。 ターゲット重みが達成されると、慢性留置頸静脈カテーテルおよび頭蓋内刺激電極と各ラットを移植外科的準備をします。 2.頚静脈カテーテルカテーテルの準備 、0.012 X 0.025 "の内径とシラスティック管の13 cmの長さを用意し、余分なシリコンチューブや電気メスを使用して、チューブの一端からシリコーンボール4センチメートルを作成し、空気乾燥させ。 数分間柑橘類由来リモネン系溶媒中でチューブのもう一方の端をディップして展開することができます。直角に曲げステンレス鋼ガイドカニューレに展開チューブを接続します。 歯科アクリルセメントを用いた生体適合性メッシュの1「乗にステンレス鋼ガイドカニューレの屈曲ベースをアンカー。 エタノールと蒸留ウォートで内と外カテーテルをフラッシュR。残留液滴を除去するために、チューブに空気を注入します。 O / Nを乾燥することができます。 無菌操作無菌外科技術を使用して専用動物手術室のすべての手術を行ってください。オートクレーブを使用して機器やインプラントを滅菌し、滅菌タオル（複数可）で覆い、テーブルの上に防水紙を置くことによって、無菌領域を準備します。 滅菌手袋を着用し、手順の間に無菌領域にすべての機器、インプラントおよび外科的なガーゼを保ちます。複数の手術が行われている手順の間にビーズ滅菌器で20秒間、続いてアルコール綿棒で各楽器を拭います。 麻酔麻酔を達成するために – （50mg / kg、腹腔20）ペントバルビタール続いアトロピン（硫酸塩）（0.04ミリグラム/キログラム、SQ）のラットを前処理。 10mg / kg、皮下またはケット – （75,000台、IM）および鎮痛薬（カルプロフェン、5滅菌ペニシリンGプロカインの懸濁液で動物を注入oprofenは、2 – 手術の直前には5mg / kg、皮下）は、それぞれ、周術期の感染症や痛みを減少させます。 動物に適度なつま先のピンチを提供することにより、十分な麻酔のためにチェックして、ても応答がない場合は、続行。両眼に眼の潤滑剤を塗布します。 手術部位の準備ちょうど肩甲骨を結ぶ線に後方ラットの背中に2×2cmの背側のパッチを剃ります。顎の骨と胸骨の間に右のネック領域に1×1センチメートル腹パッチを剃ります。 ベータダイン液に続くアルコールパッドで剃毛エリアを拭いてください。滅菌タオルにラットを置き、ベータダイン先に進む前に乾燥することができます。 カテーテル挿入 10ブレードナイフを使用して背面の肩甲骨地域で肩甲骨を結ぶ線に切開を平行にしてください。以下のための平面を作成するために、下にある結合組織から皮膚を分離するために止血剤を使用して、カテーテルベースメッシュ。滅菌生理食塩水でエリアを洗浄し、その背面にラットを回す前に滅菌ガーゼでカバーしています。 右の顎の骨と10ブレードナイフを使用して、胸骨の間に斜めの切開を行います。頚静脈を見つけるために下にある結合組織から皮膚を分離するために止血剤を使用してください。注意：頸静脈は白/銀、光沢のある表示され、女性よりも男性のラットの方が大きいです。 、静脈の下にへらを置き、露光された静脈の上部（近位部）の周りに優しく4-0絹縫合糸を結ぶとバック首に静脈を押してください。 下外側首の皮膚の下にはなく、筋肉の上に表面的なポケットを作成するために、結合組織を分離します。腕と上向きの後ろにバックトンネリングすることによって肩甲骨中央切開に首の切開部から滅菌トロカールを押してください。首の終わりからと遠位カテーテル内にトロカールを通して堅いガイドワイヤを上に挿入することにより、首に後ろからカテーテルを実行します。プル首の切開および取り付けられた遠位カテーテルまで続くバックガイドワイヤ。 以前に配置された近位縫合糸を引き上げて、へらを超える右頸静脈を分離します。静脈の上面に小さな部分カットを作るためにボールのはさみを使用してください。 それを開くために静脈切開部に湾曲した鉗子を挿入します。離れて鉗子を維持するが、代わりに、約2鉗子先端の間および静脈にカテーテルチップを渡す – それは右心房の外に終了します3センチメートル。 遠位静脈の周囲に4-0絹縫合糸を結ぶことにより、カテーテルを固定します。余分な安定性を追加するために一緒に "ボックス"結び目で近位および遠位の縫合糸を結びます。 ヘパリン処理した滅菌生理食塩水で洗い流すカテーテルおよび移植の成功を確認するために血を引きます。ノット以上2ミリメートルと首の皮膚の下に残りの近位カテー​​テルを押し込む – 縫合糸1をトリミング。あなたが選んだの適切な縫合糸/メソッドで閉じます。非absor場合bable縫合糸またはステープルが使用されている、彼らは全身麻酔下で10〜14日間で削除する必要があります。滅菌綿棒を使用して、抗生物質軟膏を切開をカバー。 メッシュベースの対角の2で吸収性縫合糸を用いて、皮下組織に戻って遠位カテーテル/ガイドカニューレ/メッシュアセンブリをアンカー。中断、非反転吸収性縫合糸を用いて、ガイドカニューレの周りに戻って切開を閉じます。滅菌綿棒を使用して、抗生物質軟膏を切開をカバー。 術後処置 3ミリリットル注射器を用いて、ヘパリン化0.9％滅菌食塩水でカテーテルをフラッシュし、目詰まりを防止するために、ガイドカニューレに栓子を配置します。 開通性を維持するために、日常的に各ラットのカテーテルをフラッシュします。 直後の手順に従って、手術室での加熱パッドの上にそのホームケージにラットを置き、意識と自発運動復帰するまで観察します。コロニー部屋に回復したラットを戻し、5〜7日は頭蓋内手術の前に渡すことができます。計量、処理し、感染をチェックし、動物の行動、外観と活動レベルを評価するなど、毎日彼らの一般的な状態を評価。 何か問題が発生した場合は動物資源の獣医師に相談し、任意の推奨される治療レジメンに従ってください。必要に応じて、手術前後の痛みを治療するために、（5ミリグラム/ kg、皮下 – – の10mg / kg、皮下またはケトプロフェン、2カルプロフェン、5）の鎮痛剤を動物に注入します。 3.頭蓋内電極の配置外科の準備 2.2節で説明したように、無菌条件下で、すべての手術を行います。 麻酔麻酔導入室で動物を置き、1,000室へのガスの流れをイソフルラン提供 – 5％に設定され、気化器と2000ミリリットル/分。 動物が横臥すると、チャンバAから削除NDパッド入りの定位オペレーティングプラットフォーム上のノーズコーンに配置します。ノーズコーンに、チャンバからのガスの流れを切り替え、2に設定され、気化器でガスを実行 – 3％。 安定した呼吸と手術中の刺激に応答なしを維持するために必要に応じて気化器を調整します。 それぞれ、周術期の感染症や痛みを減少させるために、すぐに手術前に滅菌ペニシリンGプロカインの懸濁液（75,000台、IM）および鎮痛薬（ブプレノルフィン0.05〜0.5ミリグラム/ kgの皮下注射）でラットを注入。 動物に適度なつま先のピンチを提供することにより、十分な麻酔のためにチェックして、ても応答がない場合は、続行。両眼に眼の潤滑剤を塗布します。 手術部位の準備ラットの頭の上を剃ると手順の間に、その頭の不動を維持するために耳のバーにラットを配置します。ベータダイン液に続くアルコールパッドで剃毛面積を拭いてください。ベタジン先に進む前に乾燥することができます。 電極移植ピンセットで耳の前方とベースを横断するはさみを使用しての間、わずかに頭皮をつかみます。このmanuveurは半ば頭蓋骨の上に皮膚の1.5×1cmの領域を削除します。 掻き落としと頭蓋骨膜を除去するために、ダウン頭蓋骨の頭蓋骨膜と湾曲鉗子を通じて周切開を行うために10ブレードを使用してください。 、滅菌生理食塩水でエリアを洗浄ガーゼで過剰血液や生理食塩水を軽くたたくと、頭蓋骨が完全ので、ブレグマを含む骨の目印を、乾燥させ、はっきりと見ることができます。 二国間の手術のために、2つのバイポーラ白金イリジウム電極、定位オペレーティングプラットフォームの両側の各電極ホルダーに1をマウントします。ブレグマオーバー〜1ミリメートルの位置に第一の電極を移動し、前後（AP）のための定位座標を書き留め、内側 – 外側（ML）ポジション、デジタルディスプレイに表示されます。実際にSKに電極先端に触れないでください電極が機能しなくなりますので、ULL。他の電極について、この手順を繰り返します。 最後のAPを計算し、MLは、目的の標的構造に基づいて調整します。デジタルディスプレイ上の座標初期背腹（DV）を得るためにちょうど頭蓋骨の上にチップを用いて、この位置に電極を移動します。目的の標的構造に基づいて、最終的なDVの深さを計算します。 注意：核はシェルはブレグマからの相対座標を以下の定位を使用して、薬物完了行動8におけるその既知の関与を指定して、この例で目標とした側坐核： APエントリ=座標+ 1.6 [デジタルブレグマの座標を表示] MLのエントリは、左/右2.4±[デジタルブレグマの座標を表示] =座標 DVの深さは= [デジタルAP / MLエントリで頭蓋骨の表面の座標を表示] – 8.5 永久ミリアンペアで頭蓋骨の表面上の各電極の突出エントリ位置をマークrker。この操作中、電極の先端をぶつけたり触れないでください。 各マークで1.4ミリメートルの穴をドリルダウンする丸いボールのダイヤモンドコーティングされたバリを使用してください。高速ドリルで頭蓋内ボールトに頭蓋骨を通して突入しないように注意してください。頭蓋骨が離れて掘削された後、硬膜を穿刺し、湾曲鉗子を使用してください。 頭蓋骨ねじを配置するための電極の項目の背景の追加の4つの場所で0.7ミリメートルの穴をドリルダウンする丸いボールのダイヤモンドコーティングされたバリを使用してください。正中線の各側の頭蓋骨、二つに4 0.8（直径）×3.2（長さ）mmのステンレス製ビスを配置するには、手動ドライバーを使用します。彼らは今後数週間、数ヶ月のための場所で頭蓋キャップを保持する大規模なインフラであるため、しっかりと頭蓋骨に約半分までその長さを、これらのネジを固定します。 手動でのZ座標管理ノブを回すことにより算出されたDVの深さに脳にそのburrholeを介して第1の電極を慎重に挿入電極ホルダー。電極の先端に過度の損傷を防止するために、毎秒1/2回転にほぼ等しい速度でノブを回します。脳を入力する際に​​、電極先端がburrholeの骨端に触れていないことを確認してください。 歯科用セメントに続いてスーパーburrhole上に積層接着剤および後部ネジを使用して、第一の電極を固定します。この構築物は完全に乾燥させた後、ホルダーから電極を削除します。第二の電極の挿入および接合プロセスを繰り返します。右の皮膚エッジまでの歯科用セメントを適用しますが、これは頭蓋セメントキャップ長期を緩めるため、肌と重なりません。 術後処置目詰まりを防止するため、電極の台座の上に2​​ダストキャップを配置します。 直後の手順に従って、手術室での加熱パッドの上にそのホームケージにラットを置き、意識と自発運動復帰するまで観察します。 目に回復したラットを返しますEコロニー室と5日は、実験を開始する前に渡すことができます。計量、処理し、感染をチェックし、動物の行動、外観と活動レベルを評価するなど、毎日ラットの全身状態を評価します。 何か問題が発生した場合は動物資源の獣医師に相談し、任意の推奨される治療レジメンに従ってください。必要に応じて、手術前後の痛みを治療するための鎮痛薬（ブプレノルフィン0.05から1ミリグラム/ kgの皮下）で動物を注入します。 （ – は10mg / kg、皮下またはケトプロフェン、2 – カルプロフェン、5ミリグラム/ kg、皮下）頭蓋内の出血は、非ステロイド性鎮痛薬の使用で、より普及していることができるので、頭蓋内手術のための手術時にブプレノルフィンを使用しています。 4.オペラント装置行動実験を実行するために、音減衰エンクロージャ内に含まれるプラスチックやステンレス鋼オペラント条件付けチャンバーを使用してください。 換気と白のNOIを供給するために、排気ファンと各エンクロージャーの衣装余分な音をマスクするSE。 手順をプログラムし、実験データを収集するために、パソコンや行動ソフトウェア・インターフェース・システムを使用してください。 一般的なセットアップ各レバーの上方に位置する刺激光を室内の壁一面に取り付けられた2つの応答レバーと各実験室を装備。押されたとき、それはプログラムの結果になるように、レバーの1つの「アクティブ」レバーを指定します。 薬剤の有効性を示す、すべてのオペラントセッション中に照射するために、直接アクティブレスポンスレバーの上方に位置するプログラム刺激光。 反対側の壁が5秒間に行くと刺激光が行くに家の光を伴って2.8秒以上のメタンフェタミン（100μlの0.9％NaCl中0.05ミリグラム/キログラム/注入）の注入配信でアクティブレバー結果の応答を持っています30秒のタイムアウトのオフ。 アクティブレバーの応答を数えるが、彼らには、スケジュールconseを持つべきではありません30秒のタイムアウト期間中quences。完了の場合、レコードを非アクティブレバーの応答が、彼らには、スケジュール結果を持つべきではありません。 5.静脈内（IV）のメタンフェタミン自己管理の手順一般的な準備行動のアーチファクトを最小限にするように迅速かつ冷静にできるだけオペラントチャンバーにロードラット。げっ歯類の背中にとオペラントチャンバー上に懸架漏れのない流体スイベルにガイドカニューレにステンレス製のスプリングリーシュを接続します。 音減衰エンクロージャの外側に位置し、モータ駆動ポンプで20 mlの薬物注射器にスイベルからの接続チューブの整合性を確認してください。それは適度な引きで滑り落ちなくなるまでこれを行うには、金属スイベル先端および薬物注射針の先端にプラスチックの接続チューブインチの少なくとも1/4押してください。比較的抑制されていないメートルを可能とするスイベルとリーシュアセンブリをカウンターバランス動物のovement。 月曜から金曜まで毎日ほぼ同じ時刻にオペラントセッションを実施。 取得 IVのメタンフェタミン自己投与の迅速な取得を容易にするために、四から五日間連続で毎日6時間のセッションにラットを実行します。 30秒のタイムアウトが続くラットは、アクティブレバー上の各プレスのためのIVメタンフェタミンの注入を受けるreinforcementduringの固定比率のFR-1 + 30秒のスケジュールにこれらのセッションを行い（例えば、何の手 ​​がかりや報酬結果が押すと発生しませんどちらかのレバー）。注：この初期の長期化と「簡単に」アクセスが一週間（ 図3）以下に行動を取って重要な薬剤を取得する齧歯類の大半になります。 メンテナンス IV methamを維持し、改善するために金曜まで毎日2時間のセッション月曜日にラットを実行する訓練の第2週の間、phetamine自己投与。 補強材の固定比率FR-1 + 30秒のタイムアウトのスケジュールで行動セッション。 各セッション全体のメタンフェタミンのプレゼンテーションの合計数が3連続したセッション（ 図4）と、最初の30分全体の注入の累積数の間の注入の累積数よりも大きいために10％未満に変化したときの応答を安定し、強烈な文書化第30分（ 図5）。注：この基準は、ラットは習慣性行動19とだけではなく、カジュアルな使用を示し、セッションの開始時に、薬物ローディングパターンを開発することを保証します。 セッション後各セッションの終わりには、げっ歯類の背中から紐を外します。血液凝固を防ぐために、800 IUストレプトキナーゼを含む0.9％食塩水0.1 mlのカテーテルを洗い流します。 Rを返す前に目詰まりを防止するために、各ガイドカニューレに栓子を挿入ホームケージにATS。 すぐに実験の過程を通して、水曜日に各実験セッションの終了後にカテーテルの開存性をテストします。 カテーテルの開存性をテストするために、ヘパリン処理した静菌生理食塩水を含む、22 G針で、3ccの注射器を準備します。針と動物の背中にカテーテル、カニューレアセンブリの金属ポストにもう一方の端にプラスチックチューブの4〜6インチの長片の一端を接続します。 明確な流れを確保した後、バックシリンジプランジャを描画するために生理食塩水の0.1〜0.2ミリリットルを注入。カテーテルが特許である場合、それは両方のフラッシュを容易とチューブで表示されます血を引く必要があります。プランジ​​ャーを解放し、カテーテルを通して血液バックのすべてをフラッシュするために、別の0.2ミリリットルを注入。 血液を引き出すことができない場合には、金属ポストから3ccの注射器とチューブを外します。 メトヘキシタールナトリウムを含む、22 G針で、1ccの注射器を準備し、即効麻酔薬、さらにテストカテーテル開存へ。針と動物の背中にカテーテル、カニューレアセンブリの金属ポストにもう一方の端にプラスチックチューブの4〜6インチの長片の一端を接続します。 1.5ミリグラムを注入し、すぐに動物の背中の上に金属ポストから1ccの注射器とチューブを外します。ヘパリン処理静菌食塩水で満たした3 ccのシリンジを接続し、0.1吹き込む – 0.2ミリリットルを。動物が3秒以内に筋肉の緊張を失った場合、カテーテルは、特許と機能です。 メタンフェタミン、メタンフェタミン自己投与の取得に失敗し、ラットの抽出が困難に副作用に対処する落とし穴セクションの補足ファイル」陥りやすい落とし穴」を参照してください。 6.脳刺激装置 DBS実験を実行するために10〜12プレキシ・ガラスの箱（12×18×18）（幅×高さ×奥行）を使用します。硬い不透明と外側の各ボックスをカバー閲覧または互いに相互作用ラットを防止するために、ボックスのバックとサイドをカバーしていた紙。審査官は、刺激セッション中の動物を見ることができるように明らかに明確なフロントパネルにしておきます。 空気の流れを可能にしながら逃げるのラットを防ぐ半透過性パネルを箱の上部を覆います。げっ歯類のヘッドキャップと刺激システムとの間の電気的接続を容易にするために、各ボックスの上に配置されている整流子をサポートするために、このパネルを使用します。 DBSの実験のために、複数の同時動物に一定の電流を供給することができ、刺激システムを使用してください。 （材料のシートを参照してください）​​ユーザプログラム可能なデジタル信号プロセッサ/通信インタフェース、刺激、刺激バッテリーパック、チャネルスプリッタボックス、付属するソフトウェアで構成システムを使用してください。 各commutatの優れた電子台座に刺激のチャンネルポートを接続するには、カスタムの長さのケーブルを使用しますまたは。注意：必要な長さは、個々の研究室に依存します。これらのケーブルは、動物の領域の外側であり、ステンレス鋼ばねでカバーする必要はありません。 16ステンレス鋼ばねで覆われたケーブルを使用して、げっ歯類のヘッドキャップに移植電極台座に整流子の劣る電子台座を接続します。ケーブルはヘッドキャップに大きな緊張することなく、筐体のすべての領域に自由な動きを可能にするために十分な長さであることを確認してください。注：すべての4つの足で立ったときに、ラットの頭のようになりますおおよそ終了ケーブルは通常十分です。 脳刺激プログラミング刺激パラメータ（例えば、波形、周波数、パルス幅、刺激間遅延、電流振幅）をプログラムし、実験データを収集するために、パーソナル・コンピュータやプログラミングソフトウェアを使用してください。 ビジュアルプログラミング言語を使用して、各デバイスがexperiを満たすために実行する機能を指定精神的なエンドポイントは、データが格納され、および/またはリアルタイムで表示するために投影されます。この特定のプロジェクトを実行するコマンドは 、図1に例示されています。 実験の開始に先立って、視覚的コントロールパネル（ 図2）に、所望の周波数、パルス幅、および振幅を指定します。ラットにおける高頻度刺激のための典型的なパラメータは、臨床的なヒト脳深部刺激に使用されるものと同様である：130 to180ヘルツの周波数、60〜90ミリ秒のパルス幅、及び250μA4,8-10 100の電流振幅。注：低電流は、霊長類に比べて、その縮小にげっ歯類で使用されています。 7.脳深部刺激手順箱にラットをロードするには、ヘッドキャップ上の各電極台座に整流子からステンレス製のスプリングケーブルを接続します。周波数の電流の5μAを実行して、各電極のインピーダンスをテスト2秒間千ヘルツの。 インピーダンスに等しいか125キロオーム未満である場合、電極は、治療刺激を提供することができますので、その後、実験を進めます。インピーダンスは125キロオームよりも大きい場合には、電極の高抵抗が潜在的にサブ治療レベルに電流を切り捨てる可能性があるため、実験から動物を削除することを検討。 彼らは電極ケーブル（S）に接続されているが、任意のアクティブな治療を受けていないされ、その間馴化用の1つまたは2つの模擬セッションを通してラットを実行します。模擬テストでは、任意の非特異的な行動への影響を除去することができます。直ちに各模擬セッション以下、IVのメタンフェタミン自己投与の毎日2時間のセッションのためにオペラント箱にラットを運びます。 二つのグループにカウンターバランスラット、アクティブ刺激とシャム刺激コホートベースライン薬物摂取は、群間に有意差はないように。 毎日DBSセッションを実行します彼らは能動電気脳刺激またはそのグループの割り当てに応じて、3時間無刺激のいずれかを受信する間に5日間げっ歯類コホートのS。直後のIVメタンフェタミン自己投与の毎日2時間のセッションのためにオペラント箱に各DBSセッション、輸送ラット以下。 刺激が動物の行動に明確な変化を引き起こしていないことを確認する各DBSセッションの少なくとも一部の間に慎重に動物を観察します。異常行動は刺激後/中に発生した場合、これらの観​​察を文書化するように注意してください。注：著者は、この資料に記載された実験の間に生じた重要な行動の変化や食品/水の摂取量の変化を気づいていません。 DBS治療、電気的パラメータ、およびDBSセッションと仮説に応じて、必要に応じてオペラントセッション間の時間の長さを変更します。