인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가
Summary
인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 면역 특성은 임상 응용 프로그램에 대해 점점 더 관련이 나타납니다. 형광 염료 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)로 미리 염색 엽 줄기 세포 및 말초 혈 백혈구의 공존 배양 시스템을 사용하여, 우리는 이펙터 백혈구 증식 및 특정 부분 집단에 MSC의 면역의 시험 관내 평가를 설명한다.
Abstract
The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.
Introduction
인간 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 몇 extramesodermal 계통 5뿐만 아니라, 뼈, 연골 및 지방 조직 1-4의 근축 중배엽 계통으로 분화 할 수 체세포 조상이다. 먼저 성인의 골수에서 분리,이 multilineage 조상은 지금 임상 응용 프로그램 9-12에 매우 의무 표시 강한 면역 특성을 보여, 예기치 않게, 많은 조직 6-8에서 발견되었다. 면역 효과에 관련된 자세한 메커니즘은 적극적으로 특정 질병의 실체에 효과적인 적용을 위해 연구되고있다. 면역을 평가하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이펙터 백혈구 증식 (13)의 억제에 대해 평가하는 것이다. 자극 또는 활성화되면 이러한 T 림프구 및 단핵구와 같은 대부분의 이펙터 백혈구는 비범 증식. 면역 기능이 평가 될 수있는 경우의 진압확산은 입증된다.
전통적으로, 이펙터 백혈구 증식 DNA에 [3 H] 티미 딘의 결합 검출에 의해 평가되었다. 그러나,이 방법은 복사 현상 및 후 처리의 이용에 상당한 관심 단점뿐만 아니라, 필요한 복잡한 장비를 갖는다. 세포 증식을 평가하기위한 비 방사능 분석이 있지만, 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE) 분석은 여러 유형의 세포를 포함하는 공동 배양 실험에 특히 유용하다 특정 세포 개체수의 식별을 허용하는 다른 이점을 갖는다. CFSE은 유세포 분석에 의해 평가 될 수 셀룰러 형광 염료이다. 세포 분열,이 휴대 라벨의 강도는 비례 적으로 감소된다; 이뿐만 아니라 전반적인 세포 증식의 판정을 가능하게 할뿐만 아니라 형광 DET 곤란해진다 전에 8 분할 최대 세포 분열 횟수에 평가를 허용요법 배경 신호에 대하여. 또한, 형광 CFSE의 안정성은 많은 세포가 14 개월까지 가시화 될 수있는 표지 된 세포를 생체 내 추적을 허용한다.
이 분석은 또한 이펙터 백혈구 또는 특정 집단의 면역 기능의 특정 유형을 평가하기 위해 변화 될 수의 자성 비드 표면 마커의 선택을 행함으로써 면역 백혈구 – 인터루킨 10 (IL-10)의 제조 CD14 + 단핵구 15를 MSC를 유발 이전에 또는 적절한 공동 배양 한 후 관심의 세포 집단. 우리 프로토콜 (흐름도가 도시는 (플로우 차트는도 1에 도시) 이펙터 백혈구에서 중간 엽 줄기 세포의 면역 조절 효과를 평가의 기본적인 분석 및 동종 CD4 + 이펙터 T 림프구에 MSC 유도 백혈구 면역 평가를위한 기본적인 분석의 변형을 설명 그림 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.
One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from NHRI (CS-104-PP-06 to B.L.Y.).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells,etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
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