Usando<em> Ex Vivo</em> Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
La investigación de la organogénesis en el útero es un proceso técnicamente difícil en los mamíferos placentarios, debido a la inaccesibilidad de los reactivos a los embriones que se desarrollan dentro del útero. Un método de cultivo de gotas recién desarrollado ex vivo en posición vertical ofrece una alternativa atractiva a los estudios realizados en el útero. El cultivo ex vivo gotita proporciona la capacidad de examinar y manipular las interacciones celulares y diversas vías de señalización a través del uso de diversos bloqueo y compuestos activadores; Además, los efectos de diversos reactivos farmacológicos sobre el desarrollo de órganos específicos pueden ser estudiados sin efectos secundarios no deseados de la administración de fármacos sistémico en el útero. En comparación con otros sistemas in vitro, el cultivo de gota no sólo permite la capacidad de estudio de tres dimensiones morfogénesis y las interacciones célula-célula, que no puede ser reproducida en líneas celulares de mamíferos, sino que también requiere significativamente menos reagents que otros ex vivo e in vitro. protocolos Este trabajo demuestra la disección del ratón correcto fetal órgano y técnicas de cultivo de gotita en posición vertical, seguido por inmunofluorescencia órgano completo para demostrar la eficacia del método. El método de cultivo gotita ex vivo permite la formación de la arquitectura de órganos comparable a lo que se observa in vivo y puede ser utilizado para estudiar los procesos de otro modo difíciles de estudio debido a la letalidad embrionaria en modelos in vivo. Como un sistema de solicitud de modelo, un inhibidor de molécula pequeña se utilizará para investigar el papel de la vascularización en la morfogénesis testicular. Este método de cultivo gotita ex vivo es ampliable a otros sistemas de órganos fetales, como el de pulmón y posiblemente otros, aunque cada órgano debe ser ampliamente estudiados para determinar las modificaciones órgano-específicas en el protocolo. Este sistema de cultivo de órganos ofrece flexibilidad en la experimentación con los órganos fetales, y resulta obtained usando esta técnica ayudará a los investigadores a obtener conocimientos sobre el desarrollo fetal.
Introduction
La regeneración de órganos in vivo en los seres humanos es muy limitada; Por lo tanto, la ingeniería de tejidos, el desarrollo de tejidos y órganos a partir de células individuales donados por un anfitrión, se está convirtiendo en una terapia potencial atractivo para el reemplazo de órganos. Sin embargo, para que esta estrategia terapéutica para tener éxito, los factores y las interacciones celulares implicados en la morfogénesis del órgano deben ser estudiados a fondo y bien entendidos. Debido a la incapacidad para estudiar el desarrollo de los órganos específicos con los enfoques tradicionales, los investigadores han recurrido a embrión conjunto alternativo o cultivos de órganos enteros. Kalaskar et al. 1 han demostrado que la cultura embriogénesis ex vivo toda produce resultados comparables (en el 58% de los embriones cultivados) en el desarrollo del útero, lo que sugiere que los métodos de cultivo ex vivo son una alternativa viable para los estudios de organogénesis.
Un sistema de cultivo de órganos individualizado, como este ex vivo droPlet sistema de cultivo, permite el análisis de órganos conjunto independiente de los efectos sistémicos, al tiempo que permite la manipulación de una vía de señalización específica o interacciones celulares a través de la adición de reactivos farmacológicos o anticuerpos. Tradicionalmente, el estudio de desarrollo de los órganos del feto se ha limitado a las tecnologías transgénicas y knockout de ratón, además de reactivos farmacológicos entregados por vía materna. Sin embargo, hay cuestiones técnicas que implican estas técnicas y tratamientos in vivo; la mayoría de las preocupaciones giran en torno a los efectos de influir en varios órganos simultáneamente que a menudo resulta en letalidad embrionaria. Una preocupación adicional de estudios de manipulación de desarrollo fetal farmacológicamente es el efecto materno de los fármacos sobre el desarrollo embrionario in utero (por ejemplo, el metabolismo maternal de la droga antes de que alcance el embrión) y si tales reactivos pueden pasar a través de la barrera placentaria.
La técnica de cultivo de órganos toda describióaquí fue adaptada de un protocolo descrito por primera Maatouk et al. 2, en la que las gónadas fetales enteros se incuban en cultivos ex vivo de gotas en posición vertical. Una ventaja significativa de cultivo de gónadas fetales es que los inhibidores de molécula pequeña pueden acceder fácilmente todo el órgano por difusión simple. . DeFalco et al han demostrado que la utilización de este método de cultivo gotita ex vivo en combinación con inhibidores de molécula pequeña se puede utilizar para estudiar los procesos y las interacciones que se producen durante el desarrollo de las gónadas 3 de señalización; estos procesos serían difíciles de examinar in vivo debido a problemas técnicos (por ejemplo, el paso de drogas a través de la placenta o letalidad de afectar a múltiples órganos utilizando enfoques genéticos o farmacológicos).
La cultura gotita no es sólo una mejora en algunos aspectos más de la experimentación en el útero, pero también es una mejora con respecto in vitro y ex visistemas vo también. El uso de líneas celulares para estudiar la morfogénesis es extremadamente difícil porque carecen de los diversos tipos de células, carecen de la matriz extracelular (ECM) componentes críticos que permiten la formación de la arquitectura de órganos, y pueden exhibir artefactos en las cascadas de señalización. Aunque la ingeniería de tejidos ha hecho mejoras significativas en la creación de andamios que simulan ECM, la falta de conocimiento con respecto a la cual las señales son requeridos por cada tipo de célula durante la organogénesis hace que sea difícil para construir un sistema de órganos in vitro. Otros sistemas ex vivo han sido establecidos previamente para estudiar la organogénesis, o más específicamente la morfogénesis y han sido muy exitoso para imágenes en vivo de los órganos fetales en agar 4, transwells 5, 6, filtros y otras matrices de andamio 7,8. La ventaja del sistema de cultivo gotita es que permite el estudio de la morfogénesis, proporcionando la capacidad de utilizar menos reactivos, que son often caro, pero también dando la tensión superficial de órganos, lo cual es importante para el crecimiento y la señalización de capacidades 9.
En el ratón, la morfogénesis inicial testículo tiene lugar entre embrionario (E) etapas E11.5 y E13.5; estas etapas comprenden la ventana de tiempo óptimo para los factores que influyen en la diferenciación de sexo-específicas de instrucción. Entre los procesos críticos que ocurren durante la formación de los testículos son la generación de la arquitectura cable de testículo y la formación de una red vascular-testículo específico. La utilización de este órgano vivo todo el sistema de cultivo ex gotita, uno es capaz de alterar la vascularización-masculina específica e inhibir la morfogénesis testículo mediante el uso de un inhibidor de pequeña molécula que bloquea la actividad de los receptores de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); La remodelación vascular mediada por VEGF es crítico para el desarrollo testicular 10-12. Esta técnica se puede aplicar con éxito a otros órganos y puede apuntar tiempo específicoventanas de desarrollo. Formación de imágenes de órganos Todo el montaje permite la visualización de las estructuras vitales así como los cambios estructurales y celulares resultantes de la administración de diversos inhibidores. Es importante destacar que este sistema es ventajoso en que el investigador puede pasar por alto posibles efectos de confusión de la administración del fármaco materna o la interrupción sistémica in vivo durante estrategias gen diana. Por lo tanto, todo este órgano ex vivo sistema de cultivo de gota puede mejorar significativamente la capacidad de entender las interacciones y la señalización que se producen específicamente en determinados órganos durante el desarrollo fetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio demuestra un método ex vivo gotita entera órgano que tiene muchas aplicaciones potenciales para el estudio del desarrollo fetal. Esta técnica se puede utilizar para múltiples órganos, y permite al investigador para abordar cuestiones biológicas que son difíciles de examinar usando enfoques in vivo debido a la inaccesibilidad de los embriones y el potencial letalidad embrionaria. Este método de cultivo tiene beneficios adicionales sobre otros enfoques in vitro, tales como l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
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