Usando<em> Ex Vivo</em> Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Regeneração de órgãos in vivo em seres humanos é muito limitada; por conseguinte, a engenharia de tecidos, o desenvolvimento dos tecidos e órgãos individuais de células doadas por um hospedeiro, é cada vez mais atraente uma terapia potencial para a substituição de órgãos. No entanto, para esta estratégia terapêutica para ser bem sucedido, os fatores e interações celulares envolvidos na morfogênese do órgão deve ser cuidadosamente estudado e bem-compreendido. Devido à incapacidade para estudar o desenvolvimento de órgãos específicos com abordagens tradicionais, os investigadores voltaram-se para alternativa embrião inteiro ou culturas de órgãos inteiros. Kalaskar et al. ¹ têm demonstrado que ex vivo toda a embriogênese cultura produz resultados comparáveis ​​(em 58% dos embriões cultivados) no desenvolvimento do útero, o que sugere que ex vivo métodos de cultura são uma alternativa viável para estudos de organogênese.

Um sistema de cultura de órgão individualizado, tal como este ex vivo droPlet sistema de cultura, permite a toda a análise de órgãos independente de efeitos sistémicos, enquanto permite a manipulação de uma via de sinalização específica ou interacções celulares através de adição de reagentes farmacológicos ou anticorpos. Tradicionalmente, o estudo do desenvolvimento dos órgãos do feto tem sido limitada às tecnologias transgénicos e knockout do rato, em adição aos reagentes farmacológicos entregues maternalmente. No entanto, existem problemas técnicos envolvendo essas técnicas e tratamentos in vivo; a maioria das preocupações giram em torno dos efeitos de influenciar vários órgãos simultaneamente, que muitas vezes resulta em letalidade embrionária. Uma preocupação adicional dos estudos manipulando o desenvolvimento do feto é farmacologicamente o efeito materno de drogas no desenvolvimento embrionário no útero (por exemplo, metabolismo materno do fármaco antes de alcançar o embrião) e se tais reagentes podem passar através da barreira da placenta.

A técnica de cultura de órgão inteiro descritoaqui foi adaptado a partir de um primeiro protocolo descrito por Maatouk et al. ^2, em que gônadas fetais inteiras são incubadas ex vivo em culturas de gotículas na posição vertical. Uma vantagem significativa da cultura gônadas fetais é que os inibidores de pequenas moléculas podem facilmente acessar todo o órgão por difusão simples. . DeFalco et ai demonstraram que utilizando este método ex vivo gota cultura em conjunto com inibidores de moléculas pequenas podem ser usados ​​para estudar processos e das interacções que ocorrem durante o desenvolvimento das gónadas ³ sinalização; estes processos seria difícil de examinar in vivo, devido aos desafios técnicos (por exemplo, a passagem das drogas através da placenta ou letalidade de afectar vários órgãos utilizando abordagens genéticas ou farmacológicos).

A cultura gota não é apenas uma melhoria em certos aspectos mais na experimentação útero, mas também é uma melhoria em relação in vitro e ex visistemas VO bem. A utilização de linhas de células para estudar a morfogénese é extremamente difícil porque lhes faltam os tipos de células diferentes, não têm componentes críticos da matriz extracelular (ECM) que permitem a formação de arquitectura de órgãos, e podem exibir artefactos em cascatas de sinalização. Embora a engenharia de tecidos fez melhorias significativas na criação de andaimes simulando ECM, a falta de conhecimento em relação aos quais são os sinais necessários para cada tipo celular durante a organogénese torna difícil construir um sistema do órgão in vitro. Outros sistemas ex vivo foram previamente estabelecido para estudar a organogênese, ou mais especificamente morfogênese, e tem sido muito bem sucedida para geração de imagens ao vivo de órgãos fetais em agar ^4, transwells ^{5, 6} filtros, e outras matrizes de andaime ^7,8. A vantagem do sistema de cultura de gotícula é que ele permite o estudo da morfogénese, proporcionando a capacidade de utilizar menos reagentes, que são Often caro, mas dando também a tensão da superfície de órgãos, o que é importante para o crescimento e capacidades de sinalização ^9.

No rato, a morfogênese testículo inicial ocorre entre embrionário (E) encena E11.5 e E13.5; estas fases compreendem a janela de tempo óptimo para factores que influenciam a diferenciação específicos do sexo examinar. Entre os processos críticos que ocorrem durante a formação dos testículos são a geração de arquitectura cabo de testículo e a formação de uma rede vascular específico do testículo. Utilizando este conjunto de órgãos ex vivo sistema de cultura gota, uma é capaz de alterar a vascularização específicos de macho e testículo inibir a morfogénese, através da utilização de um inibidor de molécula pequena que bloqueia a actividade dos receptores para o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); Remodelação vascular mediada por VEGF é crítico para o desenvolvimento dos testículos ^10-12. Esta técnica pode ser aplicada com sucesso para outros órgãos e pode ter como alvo tempo específicojanelas de desenvolvimento. Whole-mount imagens de órgãos permite a visualização de estruturas vitais, bem como mudanças estruturais e celulares decorrentes da administração de vários inibidores. Importante, este sistema é vantajosa na medida em que o pesquisador pode ignorar os potenciais efeitos de confusão de administração da droga materna ou perturbação sistémica in vivo durante estratégias gene alvo. Assim, todo esse órgão ex vivo sistema de cultura gota pode melhorar significativamente a capacidade de compreender as interacções e de sinalização que ocorrem especificamente dentro de determinados órgãos durante o desenvolvimento fetal.