使い方<em>エクスビボ</em>全体の胎児器官の直立飛沫培養物をマウス器官中に発生過程を研究します
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
子宮内器官を調査すると、子宮内開発胚による試薬の到達不能に胎盤哺乳類における技術的に困難なプロセスです。新たに開発されたex vivoで直立滴培養法は、 子宮内で行われた研究に魅力的な代替手段を提供します。 ex vivoでの液滴の文化は、様々なブロッキングと活性化化合物の使用を介して細胞間相互作用および多様なシグナル伝達経路を調べて、操作する能力を提供します。さらに、特定の器官の発達に様々な薬理学的試薬の影響は、 子宮内 、全身薬物送達の望ましくない副作用なしに研究することができます。他のインビトロ系と比較して、液滴の培養は、哺乳動物細胞系において再現することができない三次元の形態形成および細胞-細胞相互作用を研究する能力を可能にするだけでなく、大幅に少ない研究を必要とするだけでなく他のex vivoおよび in vitroよりもプロトコルで eagents。本稿では、適切なマウス胎児臓器解剖及び方法の有効性を実証するために、全体の臓器免疫蛍光続く直立滴培養技術を、示しています。 エキソビボ液滴の培養方法は、同等の生体内で観察され、in vivoモデルにおける胚致死によるさもなければ困難な試験プロセスを研究するために利用することができるものに臓器構造の形成を可能にします。モデルのアプリケーションシステムとして、小分子阻害剤は、精巣の形態形成における血管新生の役割を調べるために利用されます。各器官は広範囲であるプロトコルへの任意の器官特異的修飾を決定するために検討しなければならないが、これエキソビボ液滴の培養方法は、例えば、肺および潜在的に他のもののような他の胎児の臓器系に拡張可能です。この器官培養系は、胎児の器官、およびその結果と実験の柔軟性を提供するobtaineDこの技術を使用すると、研究者は、胎児の発育への洞察を得るのに役立ちます。
Introduction
ヒトにおけるインビボでの臓器再生は非常に限られています。したがって、組織工学、ホストから寄贈された個々の細胞からの組織や臓器の開発は、臓器置換のための魅力的な潜在的な治療法となってきています。しかし、成功するために、この治療戦略のために、要因や器官の形態形成に関与する細胞の相互作用は、徹底的に研究されている必要があり、よく理解していました。伝統的なアプローチと特定の器官の発達を研究することができないことに起因して、研究者は代替全胚または全臓器培養物になっています。 Kalaskar ら 1は、ex vivoでの培養方法は、器官形成研究のための実行可能な代替物である示唆し、 子宮の発達にに（培養胚の58％に）そのex vivoで全胚培養物が同等の結果が得られ示されています。
このような個別の器官培養系、 エキソビボ DROplet培養系、理学的試薬または抗体を添加することにより、特定のシグナル伝達経路や細胞間相互作用の操作を可能にしながら、全身作用の全臓器分析に依存しないために可能にします。伝統的に、胎児の器官の発達の研究は、母系配信理学的試薬に加えて、トランスジェニックおよびノックアウトマウスの技術に限定されていました。しかし、 生体内でこれらの技術や治療に関わる技術的な問題があります。最も懸念は、多くの場合、胚致死になり、同時に様々な臓器に影響を与えるの影響を中心に展開。胎児の発育を操作する研究の追加の懸念は、薬理学的にこのような試薬は、胎盤関門を通過することができる場合（ 例えば、薬剤の母体代謝が、それは胚に到達する前）と子宮内で胚発生に対する薬物の母性効果です。
全器官培養技術が記載さここで最初のMaatouk らによって記載されたプロトコルから適合させた。2、全体の胎児の生殖腺をex vivoで直立滴培養中でインキュベートされました。胎児の生殖腺を培養する1つの重要な利点は、小分子阻害剤は、容易に、単純な拡散によって全臓器にアクセスできることです。 。DeFalcoらは、小分子阻害剤と一緒にエクスビボで 、これを利用した液滴培養法は、生殖腺の発達3中に発生するプロセスとの相互作用を研究するためにシグナリングを使用することができることを示しました。これらのプロセスは、技術的な課題に、in vivoで検討するのは困難であろう（ 例えば 、胎盤または遺伝的または薬理学的ア プローチを使用して、複数の臓器に影響を与えるの致死性を通じて薬物の通過）。
液滴の文化だけでなく、 子宮内の実験で特定の側面を超えるの改善ですが、またそれは 、in vitro および ex VI以上の改善でありますVOシステムなども。これらは、多様な細胞型を欠いている器官構造の形成を可能にする重要な細胞外マトリックス（ECM）の成分を欠いており、シグナル伝達カスケード内のアーチファクトを示すことができるため、形態形成を研究するための細胞株の使用は非常に困難です。組織工学は、ECMをシミュレートする足場を作成する際に重要な改良を加えているが、信号が器官形成時の各細胞型によって必要とされるに関して知識の欠如は、それが困難なin vitroでの臓器システムを構築することができます。その他のex vivoでのシステムは、以前器官形成を研究するために設立され、より具体的形態形成、ライブ寒天4中の胎児の臓器のイメージング、トランスウェル5、フィルタ6、および他の足場マトリクス7,8のために非常に成功しているされています。液滴の培養系の利点は、Oである、より少ない試薬を利用する能力を提供することにより、形態形成の研究を可能にすることですften高価なだけでなく、成長とシグナリング機能9のために重要である臓器表面張力を、与えます。
マウスでは、初期の精巣の形態形成は、E11.5およびE13.5ステージ（E）は、胚との間で行われます。これらの段階は、性特異的分化に影響を与える要因を調べるための最適な時間ウィンドウを含みます。精巣形成時に発生する重要なプロセスの中で精巣コードアーキテクチャの生成および精巣特異的血管網の形成です。このエキソビボ全臓器滴培養系を利用して、一方が雄特異的血管新生を変化させ、小分子阻害剤の使用を介して精巣の形態形成を阻害することができることブロック血管内皮増殖因子（VEGF）の受容体の活性。 VEGF媒介血管リモデリングは、精巣の発達10-12のために重要です。この技術は、他の正常臓器に適用することができ、特定の時間をターゲットにすることができ開発の窓。全体のマウント臓器イメージングは重要な構造の可視化だけでなく、様々な阻害剤の投与に起因する構造的および細胞の変化を可能にします。重要なことには、このシステムは、研究者が、in vivoで標的遺伝子戦略の間母体薬物投与または全身崩壊からの潜在的な交絡の影響を回避することができるという点で有利で す。このように、この全体の臓器ex vivoでの液滴培養系は大幅に胎児の発達中に特定の器官内、特に発生の相互作用およびシグナル伝達を理解する能力を向上させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、胎児の発達を研究するための多くの潜在的なアプリケーションを持ってex vivoでの臓器全体ドロップレット法を示しています。この技術は、複数の器官のために使用され、in vivoで使用して検査することが困難である生物学的問題に対処するための研究が原因胚および胚の潜在的な致死の到達不能に近づくことができることができます。この培養方法は、哺乳動物細?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
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