Summary

Utilisation<em> Ex Vivo</em> Cultures Upright gouttelettes de toute fœtus organes pour étudier les processus de développement au cours de la souris Organogenèse

Published: October 21, 2015
doi:

Summary

The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Abstract

Enquêter organogenèse in utero est un processus techniquement difficile chez les mammifères placentaires raison de l'inaccessibilité de réactifs à des embryons qui se développent dans l'utérus. Une méthode ex vivo de culture vertical de gouttelettes nouvellement développé offre une alternative intéressante aux études réalisées in utero. La culture ex vivo de gouttelettes fournit la capacité d'examiner et de manipuler les interactions cellulaires et des voies de signalisation divers grâce à l'utilisation de divers composés blocage et d'activation; en outre, les effets de divers réactifs pharmacologiques sur le développement des organes spécifiques peuvent être étudiés sans effets secondaires indésirables de l'administration de médicaments systémiques in utero. Par rapport aux autres systèmes in vitro, la culture de gouttelettes permet non seulement de la capacité d'étudier les interactions à trois dimensions morphogenèse et cellule-cellule, qui ne peuvent être reproduites dans des lignées cellulaires mammaliennes, mais nécessite également beaucoup moins de reagents autre que ex vivo et in vitro dans des protocoles. Ce document démontre la dissection de souris adéquat foetal des organes et des techniques de culture de gouttelettes verticaux, suivie par immunofluorescence organe entier pour démontrer l'efficacité de la méthode. Le procédé ex vivo de culture de gouttelettes permet la formation de l'architecture d'organes comparables à ce qui est observé in vivo et peut être utilisé pour étudier les processus autrement difficiles à étudier en raison de la létalité embryonnaire dans des modèles in vivo. En tant que système d'application de modèle, un inhibiteur à petite molécule sera utilisé pour sonder le rôle de la vascularisation dans la morphogenèse des testicules. Ce procédé ex vivo de la culture des gouttelettes est extensible à d'autres systèmes d'organes du foetus, comme les poumons et potentiellement d'autres, bien que chaque organe doit être largement étudiés afin de déterminer les modifications spécifiques d'organes au protocole. Ce système de culture d'organe offre une flexibilité dans l'expérimentation avec les organes du fœtus, et les résultats obtained en utilisant cette technique aidera les chercheurs à acquérir une meilleure compréhension du développement fœtal.

Introduction

La régénération des organes in vivo chez l'homme est très limitée; par conséquent, l'ingénierie tissulaire, le développement des tissus et organes à partir de cellules individuelles donnés par un hôte, devient une thérapie potentielle attractive pour le remplacement d'organes. Cependant, pour cette stratégie thérapeutique soit couronnée de succès, les facteurs et les interactions cellulaires impliqués dans la morphogenèse de l'organe doivent être soigneusement étudiés et bien compris. En raison de l'incapacité d'étudier le développement des organes spécifiques avec les approches traditionnelles, les chercheurs se sont tournés vers l'embryon toute solution de rechange ou de cultures d'organes entiers. Kalaskar et al. 1 ont montré que la culture ex vivo de l'embryogenèse ensemble donne des résultats comparables (dans 58% des embryons cultivés) au développement in utero, suggérant que ex vivo des méthodes de culture sont une alternative possible pour les études de l'organogenèse.

Un système de culture d'organe individualisé, tel que cette ex vivo droplet système de culture, pour l'ensemble de l'analyse permet d'organe indépendant des effets systémiques, tout en permettant la manipulation d'une voie de signalisation spécifique par l'intermédiaire d'interactions cellulaires ou addition de réactifs pharmacologiques ou des anticorps. Traditionnellement, l'étude du développement des organes du fœtus a été limité à des technologies transgéniques et souris knock-out, en plus réactifs pharmacologiques livrés maternelle. Cependant, il ya des questions techniques concernant ces techniques et les traitements in vivo; la plupart des préoccupations tournent autour des effets d'influencer divers organes simultanément, ce qui se traduit souvent par une létalité embryonnaire. Une inquiétude supplémentaire d'études manipulant le développement du fœtus est pharmacologiquement l'effet maternel de médicaments sur le développement embryonnaire in utero (par exemple, le métabolisme de la mère de la drogue avant qu'elle atteigne l'embryon) et si ces réactifs peuvent passer à travers la barrière placentaire.

La technique de culture d'organe entier décriteici a été adapté à partir d'un premier protocole décrit par Maatouk et al. 2, dans laquelle les gonades fœtales entières sont mises en incubation dans des cultures ex vivo de gouttelettes verticaux. Un avantage important de la culture de gonades fœtales est que les inhibiteurs de petites molécules peuvent facilement accéder à tout l'organe par simple diffusion. . DeFalco et al ont montré que l'utilisation de cette méthode ex vivo gouttelette de culture conjointement avec les inhibiteurs à petites molécules peut être utilisée pour étudier les processus et les interactions qui se produisent au cours du développement des gonades 3 signalisation; ces processus serait difficile d'examiner in vivo en raison de problèmes techniques (par exemple, le passage de la drogue à travers le placenta ou de létalité affectant plusieurs organes en utilisant des approches génétiques ou pharmacologiques).

La culture de la gouttelette est non seulement une amélioration de certains aspects plus expérimentation in utero, mais il est aussi une amélioration par rapport in vitro et ex visystèmes vo ainsi. L'utilisation de lignées de cellules pour étudier la morphogenèse est extrêmement difficile car ils ne possèdent pas les divers types de cellules, ne disposent pas des éléments essentiels matrice extracellulaire (ECM) qui permettent la formation de l'architecture d'organes, et peuvent présenter des artefacts dans les cascades de signalisation. Bien que l'ingénierie tissulaire a apporté des améliorations significatives dans la création d'échafaudages simulant ECM, le manque de connaissances à l'égard de laquelle les signaux sont tenus par chaque type de cellule pendant l'organogenèse, il est difficile de construire un système d'organes in vitro. Autres ex vivo systèmes ont déjà été mis en place pour étudier l'organogenèse, ou plus précisément la morphogenèse, et ont eu beaucoup de succès pour l'imagerie en direct des organes du fœtus dans l'agar 4, Transwells 5, 6, filtres et autres matrices d'échafaudage 7,8. L'avantage du système de culture de gouttelettes est qu'il permet l'étude de la morphogenèse en offrant la possibilité d'utiliser moins de réactifs, qui sont des oouvent cher, mais donnant également la tension superficielle de l'organe, ce qui est important pour la capacité de croissance et de signalisation 9.

Chez la souris, la morphogenèse des testicules initiale a lieu entre embryonnaire (E) met en scène E11.5 et E13.5; Ces étapes comprennent la fenêtre temporelle optimale pour les facteurs qui influencent la différenciation spécifique du sexe d'instruction. Parmi les processus critiques qui se produisent pendant la formation du testicule sont la génération de l'architecture de la moelle testicule et la formation d'un réseau vasculaire spécifique au testicule. En utilisant cette ex vivo système de culture de gouttelettes d'organes ensemble, on est en mesure de modifier la vascularisation spécifique au mâle et inhiber testicule morphogenèse grâce à l'utilisation d'un inhibiteur à petite molécule qui bloque l'activité des récepteurs de facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF); Remodelage vasculaire VEGF est critique pour le développement des testicules 10-12. Cette technique peut être appliquée avec succès à d'autres organes et peut cibler temps spécifiquefenêtres de développement. Imagerie d'organes totalité montage permet la visualisation des structures vitales ainsi que les changements structurels et cellulaires résultant de l'administration de divers inhibiteurs. Surtout, ce système est avantageux en ce que le chercheur peut contourner les effets de confusion potentiels de l'administration de drogues par la mère ou la perturbation systémique pendant vivo stratégies de gènes ciblés dans. Ainsi, toute cette ex vivo système de culture de gouttelettes organe peut améliorer de façon significative la capacité de comprendre les interactions et la signalisation qui se produisent spécifiquement dans des organes particuliers durant le développement fœtal.

Protocol

Toutes les souris utilisées dans ces études étaient des souris CD-1 obtenues auprès de Charles River Laboratories. Précédentes expériences de culture ont également été réalisées sur d'autres souches, telles que des souris C57BL / 6J (données non présentées), mais toute souche peut être utilisée. Femmes adultes enceintes sont âgés d'environ 2-3 mois et ont été euthanasiés par inhalation de CO 2 suivie d'une dislocation cervicale et la thoracotomie bilatérale avant le retrait …

Representative Results

La culture ex vivo des gouttelettes permet de manipuler des organes entiers, tels que la gonade, pour étudier les interactions cellulaires et dynamique. La figure 1 montre d'une façon pas à pas comment préparer une culture E11.5 gonadique de gouttelettes. Les premières étapes du protocole de culture comprennent la suppression initiale de l'utérus contenant l'embryon de la souris mère (Figure 1A et 1B). Après élimination de l'utérus de la mère, la par…

Discussion

Cette étude démontre un tout méthode de gouttelettes d'organes ex vivo qui a de nombreuses applications potentielles pour étudier le développement du fœtus. Cette technique peut être utilisée pour de multiples organes, et permet au chercheur de répondre à des questions biologiques qui sont difficiles à examiner à l'aide des approches in vivo en raison de l'inaccessibilité des embryons et létalité embryonnaire potentiel. Cette méthode de culture a des avantages supplémentair…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

Materials

Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) Fisherbrand 12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible Sally Hansen N/A
8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps GeneMate T3218-1
Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L Gilson FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
Fine Scissors FST 91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes Denville C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes Denville C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1122
1000 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1126
1 ml syringe with 27gauge needles BD PrecisionGlide 309623
10 ml syringe BD 305559
0.2 μM PES syringe filter VWR 28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm Whatman 1003-185
Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish Falcon/Corning 353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) VWR 25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator Eppendorf CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet Nuare NU-425-400
Mini-centrifuge  Fisher Scientific 05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL GeneMate R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel Eppendorf 950040015
SMZ445 stereomicroscope Nikon SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software Alpha Innotech Corporation Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol Fisher BP2818-500
Triton X-100 Fisher BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 Fisher S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S671-3
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water Life Technologies AM9938 
XY PCR Primer  IDT N/A
Glacial Acetic Acid Fisher A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher BP2482-1
1% Ethidium bromide solution Fisher BP1302-10 Toxic
Agarose GeneMate E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 367176-2.5KG
Trizma Base Sigma T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions Thermo Scientific R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer Denville CB-4050-3
Paraformaldehyde Fisher O4042-500 Toxic
FluorMount-G Southern Biotech 0100-01
Hydrogen Chloride (HCl) Fisher A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation Bioexpress 0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered Fisher 03-600-511 Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140-122 Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered Sigma D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem EMD Millipore 676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody Millipore AB5535 Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody BD Pharmingen 553370 Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody Cell Signaling 9661S Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) Life Technologies 13-1900 Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate Invitrogen (Molecular Probes) H1399 Use at 2ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-165-153 Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-605-153 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A31572 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21206 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21208 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Life Technologies A31573 Use at dilution: 1:500

References

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Potter, S. J., DeFalco, T. Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis. J. Vis. Exp. (104), e53262, doi:10.3791/53262 (2015).

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