Een geoptimaliseerde werkwijze voor het isoleren en Expanding Invariant Natural Killer T-cellen van Mouse Spleen
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
De mogelijkheid om snel cytokinen na stimulatie is een functioneel kenmerk van invariante natuurlijke killercellen (iNKT) cellijn. iNKT cellen worden ook gekenmerkt als een aangeboren T-cel populatie kan activeren en sturen adaptieve immuunreacties. De ontwikkeling van verbeterde technieken voor het kweken van murine en uitbreiding iNKT cellen vergemakkelijkt de studie van iNKT celbiologie in in vitro en in vivo modelsystemen. Hier beschrijven we een optimale procedure voor de isolatie en expansie van muizen milt iNKT cellen.
Milt van C57BL / 6 muizen worden verwijderd en ontleed gespannen en de resulterende celsuspensie wordt gelaagd over dichtheidsgradiënt media. Na centrifugatie worden de milt mononucleaire cellen (MNC's) verzameld en CD5-positieve (CD5 +) lymfocyten worden verrijkt via magnetische partikels. iNKT cellen in de CD5 + fractie worden vervolgens gekleurd met ^5, GalCer-geladen CD1d tetrameer en gezuiverd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). FACS gesorteerd iNKT cellen worden vervolgens aanvankelijk gekweekt in vitro onder toepassing van een combinatie van recombinant muriene cytokines en plaat-gebonden T-celreceptor (TCR) stimuli voordat uitgebreid in de aanwezigheid van recombinant murine IL-7. Met deze techniek ongeveer 10 8 iNKT cellen kunnen worden gegenereerd binnen 18-20 dagen kweek, waarna ze kunnen worden gebruikt voor functionele assays in vitro of in vivo overdracht experimenten bij muizen.
Introduction
Muizen onveranderlijke natural killer T (iNKT) cellen zijn een afzonderlijke populatie van aangeboren T-lymfocyten geselecteerd in de thymus door-CD1d uiten corticale thymocyten 1,2. iNKT cellen brengen een T cel receptor (TCR) bestaande uit een invariant Vα14 Jα18 TCR-keten gecombineerd met ofwel Vβ8, Vβ7 of Vβ2 TCR 3, dat in staat is te herkennen endogene en buitenlandse lipide antigenen in de context van CD1d. Bijvoorbeeld, muizen iNKT cellen herkennen en worden geactiveerd door een endogene lipiden antigen isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, en α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, een glycolipide geïsoleerd uit mariene sponzen. TCR-activatie van iNKT cellen bevordert priming van adaptieve immuunreacties, en als gevolg daarvan zijn iNKT cellen aangetoond functioneel betrokken bij de verbetering of ontwikkeling van verschillende ziekten waaronder reumatische ziekten en kanker 7 <sup> 8. Momenteel, synthetische iNKT cellen liganden vormen veelbelovende vaccin adjuvantia die kunnen reguleren meerdere immuunpathologische aandoeningen kunnen zijn.
Er is eerder aangetoond dat iNKT cellen kunnen worden gegenereerd in vitro na isolering uit muizen weefsel echter; veel van deze studies met het gebruik van primaire antigeen presenterende cellen (APC's) en / of cellijnen 9, Vα14 TCR transgene (Tg) muizen 10 of thymomen voor het genereren van iNKT cellen afgeleide hybridomen 11,12. Bovendien, grote aantallen muizen, grote hoeveelheden reagentia zoals αGalCer geladen CD1d dimeren en langdurige cultuur tijden maken een aantal gepubliceerde protocollen minder ethisch en economisch aantrekkelijk 9,13.
In dit rapport beschrijven we een aangepaste methode voor de isolatie en in vitro expansie van iNKT cellen uit muizen milt. Meer specifiek protocol beschrijft een werkwijzevoor het verrijken van iNKT cellen uit muizen milt waar de muizen, reagentia en tijd vereist voor FACS-celsortering vermindert, en stelt een geoptimaliseerde aanpak voor het uitbreiden gesorteerde milt iNKT cellen in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het huidige protocol omvat de isolatie en de daaropvolgende verrijking van CD5 + lymfocyten (deel 1 & 2), FACS sorteren (deel 3) en de eerste beplating van iNKT cellen (hoofdstuk 4). Van de stappen in paragraaf 1, vergeet niet om zorgvuldig lagen de milt cellulaire schorsing over de dichtheid gradiënt medium zodanig dat een duidelijke cellulaire tussenfase wordt gegenereerd na centrifugeren. De daaropvolgende verrijking voor CD5 + lymfocyten door magnetische cel scheiding …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. . BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in ‘real time’. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
