والطريقة الأمثل لعزل وتوسيع قسما ثابتا الطبيعية الخلايا التائية القاتلة من الماوس الطحال
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
القدرة على إفراز السيتوكينات بسرعة على التحفيز هو السمة الرئيسية للثابتة القاتلة الطبيعية T (حبر) نسب الخلية. لذا تتميز الخلايا حبر باعتبارها فطرية السكان الخلايا التائية قادرة على تفعيل وتوجيه الاستجابات المناعية التكيفية. تطوير تقنيات محسنة للثقافة والتوسع في خلايا الفئران حبر تسهل دراسة حبر بيولوجيا الخلية في في التجارب المختبرية ونظم نموذج الجسم الحي. نحن هنا وصف إجراء الأمثل لعزل وتوسيع الخلايا حبر الطحال الفئران.
تتم إزالة الطحال من C57BL / 6 الفئران، تشريح وتوتر والطبقات تعليق الخلوية الناتجة على وسائل الإعلام التدرج الكثافة. بعد الطرد المركزي، يتم جمع الخلايا وحيدة النواة الطحال (الشركات المتعددة الجنسيات) ويتم إثراء CD5 إيجابية (CD5 +) الخلايا الليمفاوية لاستخدام حبات مغناطيسية. هي ملطخة الخلايا حبر في جزء CD5 + وقت لاحق مع ^5؛ GalCer محملة CD1d tetramer وتنقيته بواسطة مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). فرز FACS خلايا حبر ثم يتم تربيتها في المختبر في البداية باستخدام مزيج من السيتوكينات الفئران المؤتلف ومتجهة إلى لوحة مستقبلات الخلايا التائية (TCR) المنبهات قبل أن يتم توسيعها في وجود الفئران IL-7 المؤتلف. باستخدام هذه التقنية، ما يقرب من يمكن أن تتولد 10 8 خلايا حبر داخل 18-20 يوما للثقافة، وبعد ذلك يمكن أن تستخدم لفحوصات وظيفية في المختبر، أو في التجارب المجراة نقل في الفئران.
Introduction
الفئران القاتل الطبيعي ثابتة T (حبر) الخلايا السكان متميزة من الخلايا الليمفاوية T الفطرية المحدد في الغدة الصعترية من قبل، معربا عن CD1d thymocytes القشرية 1،2. خلايا حبر تعبر عن مستقبلات الخلايا التائية (TCR) تتألف من سلسلة ثابتة Vα14-Jα18 TCR يقترن إما Vβ8، Vβ7 أو Vβ2 TCRs 3، التي هي قادرة على الاعتراف الذاتية فضلا عن مستضدات دهن الخارجية في سياق CD1d. على سبيل المثال، الخلايا حبر الفئران تعترف ويتم تفعيلها من قبل يسمى مستضد isoglobotrihexosylceramide الدهون الذاتية (iGb3) 4، وكذلك α-galactosylceramide (αGalCer) 5،6، وشحمي سكري معزولة من الإسفنج البحري. TCR التي تعتمد على تنشيط الخلايا حبر يعزز فتيلة من الاستجابات المناعية التكيفية، ونتيجة لذلك، وقد ثبت خلايا حبر أن تكون المشاركة وظيفيا في تحسين أو تطوير مجموعة واسعة من الأمراض بما في ذلك أمراض الروماتيزم 7 وسرطان <سوب> 8. حاليا، الاصطناعية بروابط خلية حبر تشكل المواد المساعدة لقاح جديدة واعدة قد تكون قادرة على تنظيم عدد من الشروط immunopathological.
وقد سبق أن ثبت أن الخلايا حبر يمكن أن تتولد في المختبر التالية بمعزل عن الماوس الأنسجة ولكن؛ العديد من هذه الدراسات توظيف واستخدام الخلايا الأولية المقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة) و / أو خطوط الخلايا 9، Vα14 TCR المعدلة وراثيا (تيراغرام) الفئران 10، أو thymomas لتوليد حبر المشتقة من الخلايا الهجينة 11،12. وعلاوة على ذلك، فإن أعدادا كبيرة من الفئران، كميات كبيرة من المواد الكيميائية مثل dimers CD1d αGalCer تحميلها، والأوقات ثقافة طويلة تجعل بعض البروتوكولات نشرت أقل من الناحية الأخلاقية وجذابة اقتصاديا 9،13.
في هذا التقرير وصفنا طريقة تكييفها لعزل والتوسع في المختبر من خلايا حبر من الماوس الطحال. وبشكل أكثر تحديدا، ويصف بروتوكول طريقةلتخصيب خلايا حبر من الطحال الماوس مما يقلل من الفئران والكواشف والوقت اللازم لFACS فرز الخلايا، ويقترح نهجا الأمثل لتوسيع خلايا الطحال حبر فرزها في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول الحالي العزلة وإثراء لاحق من CD5 + الخلايا اللمفية (القسم 1 & 2)، FACS الفرز (القسم 3) والطلاء الأولي من خلايا حبر (القسم 4). من الخطوات التي تؤدى في القسم 1، تذكر أن طبقة بعناية تعليق الخلوي الطحال على التدرج الكثافة المتوسطة بحيث ي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. . BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in ‘real time’. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
