自動化されたモジュラーハイスループットエキソポリサッカライドスクリーニングプラットフォームは、高感度炭水化物フィンガープリント分析と相まって

1.自動スクリーニング注：すべての液体処理手順は、ロボット液体ハンドリングシステムで行われています。ロボットワークテーブルの構成は、 図2に示されている。特に断りのない限り全ての消耗品は、貯蔵カルーセルに格納されています。すべての自動スクリーニングは、ロボットマニピュレータ（RM）は消耗品を移動させる手順については（ディープウェルプレート（DWP）;マイクロタイタープレート（MTP）;ポリメラーゼ連鎖反応プレート（PCR-プレート）など）カルーセル位置の間（CP ）とワークテーブル位置（WTP）。すべてのピペットのステップは、それが特に言及されている場合を除いて、96チャンネルピペットアームを用いて行われます。すべてのステップは、プログラムされ、96ウェルフォーマットで自動的に実行されます。 ひずみ栽培（ 図1中のタスク1） 注：株を生成する推定上のEPSの接種および無菌状態（層流）の下での培養プレートのシールを処理します。自動化高速スクリーニングは、実行ごとに4つの96ウェルプレートを処理することができます。いくつかの属の異なる株は、すでに6を試験しました。 手動で96ウェルグリセロールストックプレートから96ピンレプリケータで前培養（1ミリリットルEPSメディアDWP中）を接種します。蒸発を避けるために、通気を可能にする通気性封止フィルムでプレートを覆います。 MTP-シェーカー上で1000rpmで48時間、30℃でインキュベートします。 50μlの12チャンネルマルチピペットを用いて前培養と同様の条件下でインキュベートする前培養物10μlを移すことによって、主培養（DWPで990μlのEPSメディア）を接種します。成長しないすべての株をメモしておいてください。 ロボットワークテーブルとストレージカルーセルの調製ストレージカルーセル内の正しい位置に材料や機器に記載されているすべての消耗品を提供します。目のための100の希釈：1のためにDWPの各ウェルに二重蒸留水（のddH 2 O）の990μLを追加電子グルコースアッセイ（カルーセル位置4-1〜4-4）。 ワークテーブルの位置（WTP）11でのddH 2 Oの150ミリリットルを含む250ミリリットルトラフを配置します。 50mlのグルコースアッセイ試薬ミックス（4 500mLのmMリン酸カリウム（pHは5.7）を1.5mlの50mM 2.2-azinobis-（3ethylbenzthiazoline）-6-スルホン酸2mlの100 Uグルコースオキシダーゼを含む250 mlのトラフを堆積位置WTP 1-2で10μlの千U西洋ワサビペルオキシダーゼおよび42.49ミリリットルののddH 2 O）。 位置WTP 3-1,3-2で2つの空のダミーF-底のMTPを置きます。 、通気性封止フィルムを取り外し1-1〜1-4カルーセル位置（CP）でメインの文化を割り当て、自動ロボットプログラムを起動します。 ゲルろ過プレートの平衡化注：このスクリーニング中に使用されるゲルろ過プレートを再利用することができます。このために、20℃で2分間、2000×gでのddH 2 O150μlで3回ずつ洗浄し、遠心分離器。その後、4で保存20％エタノール75μlのとC°とシリコンキャップマットでカバー。 WTP 3-3に5 mMの酢酸アンモニウム緩衝液（pH 5.6）を用いて250mlのトラフ（CP 5-7）を移動させます。 4-4にWTPs 4-1にカルーセルからゲルろ過プレート（CP 1-6、1-7、2-6と2-7）を転送します。 吸引酢酸アンモニウム緩衝液150μlを200μlのチップを用いて平衡化のために、すべてのゲル濾過プレートの中心に分配します。 （20℃、2000×gで2分間）遠心機にゲル濾過プレートを転送します。 ステップ1.3.3、1.3.4と1.3.3を繰り返し、ワークテーブルに戻って、プレートを転送します。ゲル濾過プレートの脱水を避けるために、遠心分離工程を繰り返さないでください。バックカルーセル内で平衡化したゲルろ過プレートを保管してください。 遠心分離（ 図1中のタスク1）を介して細胞除去注：スクリーニングアプローチ内の低バックグラウンドを確保するために、遊離の細胞を分析しますEPSは、上清のみを含有し、培養後、遠心分離を介して細胞を除去します。 遠心分離（20℃で30分間、4300×gで）にカルーセル（1-1〜1-4）から主培養DWPを転送します。 主培養を処理するためにRMを経由してワークテーブルを準備します。 注意：手順1.4.2については、システムが常に並列に二つのプレートを処理した後、次の二つのプレートを持つすべてのステップを繰り返す1.4.3.5します。 濾過前の沈殿のためにWTP 4-1及び5-1にCP 6-1,6-2からのMTPを移動します。 WTP 4-2及び5-2にCP 7-1及び7-2からのpH指示薬のMTPを移動します。 WTP 4-3及び5-3にCP 2-1,2-2からの集電板と一緒に濾過プレートを転送します。 WTP 4-4及び5-4に遠心分離機から主培養DWP 1-1,1-2を再配置します。 分析モジュールを準備します。 注意：先端のストレージ（位置2-1〜2-4）から200μlのヒントをください。消耗を低減するために、ステップ1と同じチップセットを使用します.4.3.1。 濾過プレートにメイン培養上清180μlのを転送します。メイン培養上清から吸引し、150μlのおよびpH指示薬プレートにろ過し、100μlの前に沈殿のためのMTPに50μLを分注します。 注：pHを決意は必須ではありません。しかしながら、マルチステップピペットで各ウェルに12.5 mlのメチルレッド指示薬（50mLのエタノール中の50 mg）を添加した後には、高酸産生株を示します。この情報は、より高い緩衝液濃度を有する第二のスクリーニングのために、例えばさらなる栽培用（低pHで）成長阻害を回避するのに有用であり得ます。さらに、低いpHが酸性環境に対して細胞を保護するためにEPS産生を誘導することができます。 第二主培養プレートのための手順を繰り返し1.4.3.1。新鮮なチップセットを使用してください。 遠心分離機に濾過プレートを移動し、carousにホームポジションに戻し、ワークテーブルから他のすべてのプレートを取り外しますエル。 第三及び第四の主培養プレートのために1.4.3.3へのステップ1.4.2.1を繰り返します。 彼らはカルーセル（粘度調整）に戻って転送されたとき、メイン培養プレートの遠心分離後の沈殿を減少させたショーそれらの発酵ブロスのノートを取ります。 完全な細胞除去のための96ウェル濾過（ 図1中のタスク2） 注：濾過工程がスクリーニングに含まれる粘性の発酵ブロスからの細胞の除去を確実にするために。 20℃で10分間3,000×gで濾過プレートを遠心分離し、バックそれらのカルーセルホームポジションにそれらをもたらします。 ゲルろ過プレートを準備します。 20℃で2分間千×gで遠心分離し、スピンにカルーセルから平衡化したゲルろ過板を移動します。 44にWTP 4-1に遠心分離機からゲルろ過プレートを転送します。 新鮮なゲルを移動しますWTPへのCPから（3-1〜3-4）-filtrationの集電板（5-1 5-4）。 新鮮な集電板（5-4 5-1）に（4-4 WTP 4-1）平衡化したゲル濾過プレートを転送します。 位置5-1と5-2を除くワークテーブルをクリーンアップし、4-1を配置する位置5-1を移動します。 ろ液を処理するためにRMを経由してワークテーブルを準備します。 注：システムを1.6.3.5にする手順1.5.3並列に二つのプレートを処理し、次の二つのプレートを持つすべてのステップを繰り返します。 WTP 3-3及び3-4にカルーセル（4-6及び4-7）から50μlのヒントを移動します。 ワークテーブル（4-4及び5-4）に3-2にCP 3-1から濾過プレートを転送します。 CP 4-1,4-2からのWTP 4-2及び5-1にグルコース消費の検出のために：（100希釈1）DWPを再配置します。 WTP 4-3及び5-3にCP 8-1,8-2からろ過した後、2回目の沈殿のためにMTPを移動します。 集電板から濾過プレートを持ち上げS（WTP 4-4及び5-4）とWTP 3-1及び3-2に移動します。 濾過後の分析モジュールを準備します。消耗を低減するために、ステップ1.5.4.1と1.5.4.3のための同じチップセットを使用します。 50μlのヒントを取り、DWPにろ液の10μlのアリコートをピペット：グルコースアッセイ（グルコース消費）のために（1 100希釈）。 ピペットで平衡化したゲル濾過プレートの中心までのろ液の35μlを、沈殿のために使用されているMTPに50μlの。 繰り返しは、第二の濾過プレートのための1.5.4.2に1.5.4.1を繰り返します。 遠心分離機にゲルろ過プレートを移動し、カルーセル内のホームポジションに戻ってワークテーブルから他のすべてのプレートを移動します。 繰り返しは、第3および第4の濾過プレートのための1.5.4.4に1.5.3.1を繰り返します。 すべてのプレートの貯蔵後の後ろにフィルタープレートに残差によって示されるように高粘性上清のカルーセルテイクノート、（高V IN濾過工程の後iscosity制御）。ろ液の欠如は、以下の分析モジュール内の偽陰性の結果につながることができます。 96ウェルのゲルろ過を介したグルコースの除去（ 図1中のタスク3） 20℃で2分間1000×gでのゲル濾過プレートを遠心。 ゲルろ液を処理するためにロボットマニピュレータを経由してワークテーブルを準備します。 WTP 3-3及び3-4にカルーセル（5-3及び5-4）から50μlのヒントを提供します。 ゲルろ過した後、残りのグルコースの決意についてWTP 4-1及び5-1にCP 9-1及び9-2からの2のMTPを移動します。 フェノール – 硫酸酸法ではWTP 4-2及び5-2にCP 8-5及び8-6からの2のMTPを移動します。 WTP（4-3及び5-3）に遠心分離機から2ゲルろ過プレートを転送します。 集電板（4-3及び5-3）からゲル濾過プレートを持ち上げ、WTP 3-1及び3-2に移動します。 ゲルろ液を処理するためにロボットマニピュレータを経由してワークテーブルを準備します。 注：消耗を低減するために、使用するのと同じチップセットの手順1.6.3.1と1.6.3.2のために。 ゲルろ過（1:10希釈）した後、残りのグルコースを検出するために、50μlのヒントを取り、新鮮なMTPにのddH 2 O（WTP 1-1）を25μlを移します。 ddH 2 O（WTP 1-1）の吸引物20μlを、空気の5μlを、ゲルろ液を5μlと同じプレートに分注します。 フェノール – 硫酸酸法ピペットMTPにゲルろ液の20μlのために。 繰り返して第二のゲルろ過液プレート用の1.6.3.1と1.6.3.2を繰り返します。 彼らのカルーセルでホームポジションに戻ってワークテーブルからすべてのプレートを転送します。 第三及び第四のゲル濾過プレートのために1.6.3.4へのステップ1.6.2.1を繰り返します。 グルコースアッセイモジュールグルコースなどを実行するためにロボットマニピュレータを経由してワークテーブルを準備しますいう。 WTP 5-1及び5-4にCP 4-1と4-4から：（100希釈1）DWPを再配置します。 WTP 4-1及び4-4にCP 9-5及び9-8からすべてのMTPを移動します。 200μlのヒントを取り、180μlと10倍の量を吸引し分配することによって希釈を混ぜます。その後、MTPに50μlのアリコートをピペット。 （1：100希釈）を繰り返して、すべての4つのDWPsための1.7.1.2と1.7.1.3手順。 ワークテーブルからすべてのDWPs（5-4 5-1）を削除します。 グルコースアッセイを開始するためにワークテーブルを準備します。 WTPにゲルろ過転送CPからすべてのMTP（9-4 9-1）（5-1 5-4）した後、残りのグルコースの決意のため。 3回以下のグルコース濃度の50μlの（90、45、18、9、4.5、1.8、0.9、0.45および0ミリグラム/ L）を含む – – グルコースアッセイキャリブレーションプレートを移動CP 9-9からWTP 3- 3。 200μlのヒントや吸引Wからのグルコース測定試薬ミックス50μlのを取りますTP 1-2は、第一のアッセイを開始します。インキュベーター（30分間150rpmで30°C）に、MTPは移動します。 プレート間で5分遅れでプログラムを起動するためにタイムスケジュールを設定します。 インキュベーションの30分後、418および480 nmでMTPリーダーとレコード吸光度をインキュベーターからプレートを移動させます。 測定後、カルーセルでのホームポジションにプレートを移動させます。 降水の調製注：EPSの生産は第1の濾過工程の前及び後、2-プロパノールと上清の沈殿を行う評価するために。また、最初にではなく、2回目の沈殿中の繊維およびフレークの観察によりフィルター膜上にポリマーの吸着を評価します。 注意：厳密にヒュームフードの下で引火性液体として2-プロパノールを処理します。 （CP 6-1 6-4と8-1〜8-4）カルーセルからすべての沈殿プレートを取り外します。そして、追加12.5 mlのマルチステップピペットで各ウェルへ2-プロパノールの手動150μlの。 シリコーンキャップマットを持つすべてのMTPを覆い、室温（RT）（900 rpmで10分）に振ります。視覚EPS産生を示すこと振った後、繊維またはフレーク形成を観察します。 フェノール – 硫酸酸法注意：ヒュームフードの下で濃硫酸-酸とフェノールを処理します。フェノールは、腐食性および変異原性物質です。 フェノール – 硫酸酸法では、カルーセルから（CP 8-8へ8-5）プレートを取り外し、液体ハンドリングシステム（〜8ポジション4）に入れます。 （; 5; 2.5; 1; 0.5; 0.25; 0.1; 0.05; 0グラム/ L 10）三重で異なるグルコース濃度を20μlと校正用プレートが含まれます。 ddH 2 Oで1位の廃棄物容器、2位の200μlの先端ボックスと110ミリリットルのフェノール-硫酸酸と250ミリリットルトラフを（新たミリリットルフェノールwith18.3氷5％（w / vの上に用意）を配置濃および91.7ミリリットル。sの3位のulfuric酸）。 300μlのヒントを8チャンネルピペットを使用し、全てのプレートの各行にフェノール – 硫酸酸180μlのを転送します。 蓋を持つすべてのMTPをカバーし、（900rpmで、室温で5分間）振盪することによって、それらをミックスし、呈色反応のためのオーブンで80℃で35分間、それらをインキュベートします。ヒュームフードの下で冷却した後、480 nmの吸光度を測定します。 EPSポジティブ上清（ 図1のタスク4）の選択 EPS生産の評価のために、陽性（粘度調整2.6.1および2.6.2、ポリマー2.6.3の検出、グルコース同等2.6.5）のような3つの条件のうち少なくとも二つを満たす自動スクリーニングからこれらの株を選択します。さらなる処理のための新しいMTPに陽性ヒットから残りのろ液を移します。 注意：プレートを、それらが少なくとも1週間-20℃で保存することができるアルミニウムシーリングフィルムで覆われている場合。その時間内にdetermina炭水化物指紋化を行う必要があります。 2.炭水化物指紋注：炭水化物フィンガープリントのためのすべての手順を手動で実行されています。 ポジティブ上清のゲル濾過（ 図1における作業5） 注：自動スクリーニングから残されたろ液が存在しないようにゲルろ過が必要です。減少浄化効率以上35μlの結果の容量を持つゲルろ過。 12.5ミリリットル多段階のピペットを用いて、すべてのウェルに酢酸アンモニウム緩衝液150μlのを分配することによって、ゲル濾過プレートの平衡を準備します。 （20℃、2000×gで2分間）遠心機にゲル濾過プレートを転送します。 繰り返しは2.1.1、2.1.2と再び2.1.1を繰り返します。さらに、使用前に20℃で2分間1,000×gで遠心分離ゲルろ過プレート。 ピペットろ液の35μlの中へ12チャネル50μlのピペットを用いてゲルろ過プレートの中心。 20℃で2分間千×gでゲルろ過プレートを遠心した後、集電板から持ち上げます。 加水分解の前にグルコースアッセイの準備：12チャンネル50μlのピペットを用いてゲル濾過液ののddH 2 Oおよび5μlの45μlのを追加することで1:10希釈を行い、シリコーンキャップマットとのMTPをカバーしています。 注：ポリマーのグルコース値の正しい決意するために、加水分解前のグルコース含量を測定し、加水分解工程の後に定量したグルコース量から差し引きます。 加水分解の前にピルビン酸アッセイを準備：各ウェルにのddH 2 O、ゲル濾過液の転送5μlと95μlを添加し、シリコンキャップマットでMTPを密封するために12チャンネル200μlのピペットを用いて1時20希釈を行います。 96ウェルマイクロ加水分解（ 図1中のタスク6） 注：ヒートアップ使用する前に、少なくとも1.5時間、121°Cまで（砂浴を含む）インキュベーションオーブン。特別なクランプ装置は小規模な加水分解工程中の蒸発を避けるために開発されました。 新しいPCRプレートを取り、12チャンネル50μlのピペットを用いてゲル濾過液を20μlを移します。 注意：トリフルオロ酢酸は腐食性の酸と有毒です。アンモニウム溶液は腐食性があります。唯一のヒュームフードの下で両方の化学物質を扱います。 各ウェルに1.25ミリリットルマルチステップピペットで4 Mトリフルオロ酢酸の20μLを加えます。その後、熱可塑性エラストマー（TPE）キャップマットでPCRプレートをカバーし、特別なクランプ装置でPCRプレートを配置します。 クランプ装置を10回反転介し溶液を混合。遠心分離機でPCRプレートを入れて、底にすべての液体を収集するために2分間2000×gでスピン。 PCRプレートは、バッククランプ装置に入れて、ネジでデバイスを固定します。 置き予熱した砂浴中でデバイスをクランプ固定し、121℃で90分間インキュベートします。 砂浴からクランプ装置を取り外し、それを室温まで冷却しましょう​​。 ネジを外し、ウェルの底にすべて凝縮物を収集し、キャップマットの除去中に交差汚染を防止するために、2分間2000×gで遠心分離で再びスピン。 約にpHを調整するために3.2％のアンモニア溶液を追加します。 8 12チャンネル200μlのピペットを使用して。 TPEキャップマットでPCRプレートを覆い、クランプ装置を使用して手動でそれを振ります。 中和した後、2分間2000×gでPCRプレートを遠心します。 ハイスループット-1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン（ 図1のタスク7）炭水化物の（HT-PMP）-derivatization 転送12チャンネル50μlのピペットを用いて、新鮮なPCRプレート中で中和加水分解物25μlの。 注：アリコートを取った後、neutrをチェック1.25ミリリットルマルチステップピペットで12.5μlのフェノールレッド指示薬（5 mlの20％エタノール中の0.05グラムのフェノールレッド）を添加することを介して、加水分解プレートの残りの液体のalization。ピンク色液（pH 8）に変わりはありませんすべてのウェルが正しく誘導体化されていません。 75μlの誘導体化試薬ミックス（125ミリグラムPMP、7ミリリットルのメタノール、3.06ミリリットルののddH 2 O、および438μlの3.2％のアンモニウム溶液）を追加し、TPEキャップマットでプレートをカバーしています。 底にすべての液体を蓄積するために2分間、2000×gでクランプ装置遠心分離機プレートでPCRプレートを振盪した後。 誘導体化場所については100分間、70℃でPCR-サイクラーでPCRプレートを20℃まで冷却しました。 12チャンネル50μlのピペットを使用して、新しいMTPに20μlのアリコートを転送します。そして、12チャンネル200μlのピペットを使用し、各ラインに130μlの19.23ミリモルを酢酸（0.962ミリリットル1 M酢酸+ 49.038ミリリットルののddH 2 O）を追加します。 aspirat経由で直接混ぜますると（最低6回）調剤およびMTPの集電板と0.2μmのフィルタープレートにすべての液体を移します。 遠心分離板（5分間千XG）は、フィルタープレートを取り外しシリコーンキャップマットでMTPを密封し、炭水化物フィンガープリント14の決意のためUHPLC-UV-ESI-MSにMTPを配置します。 グルコースアッセイの調製 ddH 2 O45μlの12チャンネル50μlのピペットを用いて中和された加水分解物の5μLを加えることを経由して1:10希釈を行い、シリコーンキャップマットとのMTPをカバーしています。キャリブレーションのために使用される新しいMTPに3回50種類のグルコース標準μlの（500、250、100、50、25、10、5、2.5および0μM）を追加します。 12チャンネル50μlのピペットを用いて、グルコース測定試薬ミックス（レシピstep1.2.3）の50μLを加えます。その後、シリコンキャップマットでプレートをカバーし、MTP-インキュベーター内で30分間、30℃、400rpmでインキュベートします。 <li>直接インキュベーション後、MTPリーダーで418と480 nmでMTP-リーダーで読み取った吸光度を作ります。ステップ2.6.4で実行されるようなグルコース濃度の計算のために線形キャリブレーションを行います。 ピルビン酸アッセイの調製 12チャンネル200μlのピペットを用いて、1：20希釈を行います。各ウェルにのddH 2 Oおよび転送に中和加水分解物の5μlに95μlを添加します。シリコンキャップマットでMTPをカバーしています。 ピルビン酸アッセイ試薬ミックスの100μLを加える（3ミリリットル1 mMのN – （カルボキシメチルアミノカルボニル）-4.4'ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（DA-64）、300μlの10 mMのチアミンピロリン酸、60μlの100 mMの塩化マグネシウム六水和物2.4 500mLのmMのリン酸カリウムパファー液（pH 5.7）、30μlの100 Uのピルビン酸オキシダーゼ、12μlの千U西洋ワサビペルオキシダーゼと12チャンネル200μlのピペットを用いて24.19ミリリットルのddH 2 O）。 シリコンキャップマットAでプレートをカバーND 37℃で30分間150rpmでインキュベートします。直接727および540 nmでMTPリーダーでインキュベーション対策吸光度の後。 自動化されたスクリーニングおよび炭水化物フィンガープリントのすべての結果の評価。 主培養プレートを遠心分離し、カルーセル（粘度制御ステップ1.4.1）に戻って格納された後に沈降を減少ショーこれらのサンプルをメモしておいてください。ペレットの形成を示さないサンプルは、（自動スクリーニングのための基準1）陽性です。 濾過工程（高粘度制御ステップ1.5.4.6）の後、フィルタープレートに残差により示されている高粘性上清、に注意してください。ろ液の欠如は、以下の分析モジュール内の偽陰性結果につながることができます。フィルタウェルに培養上清を維持するサンプルは（も自動スクリーニングのための1を基準）陽性です。 視覚インキュベーション後の繊維またはフレーク形成を観察します。目のようにメモを取ります多糖類を示しています。 （ – ）と降水量を評価しません。 （++）を有する繊維またはフレーク（+）とし、高い降水量の低い降水量。また、最初にではなく、2回目の沈殿（自動スクリーニングのための基準2）に、繊維およびフレークの観察を経てフィルター膜上にポリマーの吸着を検出します。 グルコース濃度の計算のための線形キャリブレーションを実行します。 この式の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 5〜0.1グラム/ Lのグルコースとの間の直線キャリブレーション（濃度以上の吸収）を実行します。加水分解されたポリマーのグルコース同等の計算とパラメータ以下により評価：グルコース当量：> 700 mg / Lで=正を。正推定される300〜700 mg / Lで=。 EPS形式の点で<300 mg / Lで=負イオン（自動スクリーニングのための基準3）。 この式の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 HT-PMP法で決定すべての炭水化物を定量化します。すべての数量をまとめると次のように評価する：> 300 mg / Lで（正）; 150から300 mg / Lで（推定正）と<150 mg / Lで（ネガティブ）。 ピルビン酸濃度の計算のための検量線の直線性（100、50、25、10、5、2.5、1、0.5および0μM）を行います。上清中の残りのピルビン酸を除外するには、加水分解前のピルビン酸含有量を介して加水分解後のピルビン酸含有量を補正します。 このequatの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。イオン。