Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

1. aktiflediği insan T hücrelerindeki hazırlayın Damarından bir donörden tam kan heparinize 10 ml toplayın. Venipunktür önceden donörlerin aydınlatılmış onam. Venipunktür kalifiye ve eğitimli personel tarafından yapılmalıdır. Steril ekipman ve aşağıdaki uygun biyogüvenlik kurallarına elde edilen kan örnekleri taşıyınız. 10 ml D-PBS ile bütün kan heparinize 10 ml seyreltik (-). Yeni 50-ml konik tüp içine 15 ml Ficoll solüsyonu (Ficoll Paque PREMIUM) koyun. Adım 1.3 Ficoll çözeltisi üzerine Adım 1.2 hazırlanan 20 ml kan çözümü Katman. Elektrikli bir pipet kullanılarak, kan solüsyonu tüpün iç duvarı boyunca yavaş yavaş Aşama 1,2 çalıştırmak hazırlandı sağlar. Kan çözümü ve Ficoll çözüm karıştırmak için dikkatli olun. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. "Yavaş" santrifüj yavaşlama hızını ayarlayın. Not: Santrifüj işleminden sonra, beyaz bir incetabaka bir üst sütlü plazma tabakası ve alt net bir Ficoll katmanı arasında ortaya çıkar. Bu beyaz ince tabaka mononükleer hücreleri içerir. Bir 1 ml pipet ile yeni bir 50-ml'lik konik tüpe tek çekirdekli hücre katmanı aktarın. Ficoll çözüm dahil vermemek için dikkatli olun. D-PBS (-) ekleyin, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de, toplam 10 ml'lik bir hacme ve santrifüj mononükleer hücrelerine temin etmektedir. Süpernatantı atın. Tek-çekirdekli hücreleri, ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj (-) D-PBS, 10 ml ekleyin. Süpernatantı atın toplanan mononükleer hücrelere KBM502 orta 1 ml ekleyin ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. X 10 6 5 üzerinde tek çekirdekli hücreler, uygun bir ayırma Ficoll kullanılarak, tam kanın heparinize 10 ml elde edilebilir. D-PBS içinde 10 ug / ml'lik bir konsantrasyonda, bir anti-insan CD3 antikoru solüsyonu hazırlayın (-). Sörf emmek 6-çukurlu plaka anti-insan CD3 antikoru solüsyonu ilaveHer bir ası de ve en az 30 dakika boyunca% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe çanak. Her bir anti-insan CD3 antikor çözüm çıkarın ve D-PBS ile bir kez yıkanır (-) tohum hücreleri hemen önce. KBM502 ortam içinde anti-insan CD3 antikoru ile kaplanmış 6-yuvalı plakalar üzerinde 2.5 x 10 5 hücre / cm2 yoğunluğunda Aşama 1,9 hazırlandı Tohum mononükleer hücreleri. T hücreleri konfluansa ulaşana kadar bir ortam değişikliği olmadan 3-7 gün boyunca% 5 -CO 2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edilir. Bu dönemde, T-hücreleri, hem süspansiyon haline getirilmiş ve yapışan hücreler bulunmaktadır. SeV Vektörler 2. Infect İnsan T hücrelerinin 3-7 gün kültürden sonra, pipetleme orta mevcut aktive edilmiş T hücreleri toplamak. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g 'de 15 ml konik tüp ve santrifüj aktarın. Süpernatantı ve 1 ml taze KBM502 orta ekleyin. Hücreleri saymak ve 1 plaka.5 x 10 6 hücre, bir anti-CD3 antikoru ile kaplanmış 6-çukurlu plakanın her oyuğuna (2 ml taze KBM502 ortamı içerisinde). Buz üzerinde Zeiss OCT3 / 4-SeV / TSΔF, Sox2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF ve c-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF arasında SeV çözüm çözülme. Zeiss OCT3 / 4-SeV / TSΔF, Sox2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF ve c-myc (HNL) ihtiva eden SeV çözümler ekleyin -SeV / TS15ΔF ayrı ayrı gözlere, enfeksiyon çokluğunda her (MOI) Bir başka 24 saat süreyle% 5 -CO 2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe 10. bölgesinin. 3. İnsan T Hücreleri SeV Vektörler kaldır 24 saat enfeksiyondan sonra, bir pipetle enfekte hücreleri toplamak. Yapışan hücreler varsa, onlar kolayca defalarca yukarı ve aşağı onları pipetleme ayrılabilir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g 'de 15 ml konik tüp, ve santrifüj aktarın. SeV vektörleri içeren süpernatant kaldırmak ve 2 ml taze KBM502 orta ekleyin. EAC içinde Replate hücrelerkuyuların h. Ek bir 24 saat boyunca bir% 5 -CO 2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edilir. Bir Matrigel Katman 4. reseed Hücreler 4 ° C 'de (Bu çalışmada kullanılan özel markasıyla Malzeme Listesi bakınız) ve DMEM / F12 ortamı içinde 10 ml 0.2 ml eritilmesi çözülme matris jel bazal membran matrisi çözeltisi hazırlayın. Not: The Matrix jeli (bu çalışmada kullanılan belirli bir marka için malzemeler listesi bakınız) 4 ° C'de tamamen çözülmüş olması O / N çözülme gerekiyor. Kullanmadan önce kadar buz üzerinde tutun. 100 mm'lik tabaklara tabak başına Levha 5 mi bazal membran matrisi çözeltisi ve tohum hücreleri önce en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. En az iki adet 100 mm çanağı bir deney için ihtiyaç vardır. , Pipetleme SeV enfekte olmuş hücreleri toplamak, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml konik tüp, ve santrifüj aktarın. Süpernatantı ve 1 ml taze KBM502 orta ekleyin. Ce sayısınıHemasitometre kullanarak lls Adım 4.2 ve plaka hazırlanan 100 mm yemeklerinden bazal membran matris çözümü kaldırmak 1 × 10 5 ve 1 × 10 6 hücre 100 mm bazal membran matris kaplı üzerinde (10 ml taze mTeSR orta olarak) yemekler. Son olarak, koloniler kolayca çekilen hangi plakayı kullanın. % 5 CO 2 inkübatör O / N 37 ° C 'de çanak inkübe edin. 10 orta değiştirmek mi her gün mTeSR orta eti. Not: enfeksiyondan sonra yaklaşık 20-30 gün, yakından embriyonik kök hücreler (EKH) benzer koloniler görünecektir. 5. T-hücresinden alınan iPSCs aç 4 ° C 'de (Bu çalışmada kullanılan özel markasıyla Malzeme Listesi bakınız) ve DMEM / F12 ortamı içinde 10 ml 0.2 ml eritilmesi çözülme matris jel bazal membran matrisi çözeltisi hazırlayın. Levha 1, 6-çukurlu plaka içinde çukur başına bazal membran matrisi çözeltisi ve en oda sıcaklığında bırakınkoloniler almadan önce en az 30 dakika. MTeSR ortamının 20 ul, 96 oyuklu bir plaka Dolgu ile sabitleştirilir. 20 ul pipet kullanarak stereomicroscope altında EKH benzer koloniler seçin. Not: Şekil 1B gösterildiği gibi EKH ve iPSCs kolonileri yuvarlak ve düzdür. Aşama 5.3 mTeSR ortamı ile doldurulmuş 96 oyuklu bir plakaya transfer seçilmiş kolonileri. 200 ul pipet kullanarak stereomicroscope altında küçük öbekler halinde koloni kırmak için aşağı yukarı pipet ve dikkatle her kuyuya mTeSR orta 200 ul ekleyin ve. 5.2 de hazırlanan gelen bazal membran matrisi çözeltisi çıkarın ve mTeSR orta 2 ml bazal membran matris ile kaplanmış 6-çukurlu plakanın bir oyuğuna, her bir koloni koyun ile sabitleştirilir. 2 orta değiştirmek mi her gün mTeSR orta eti. 6. T hücre-türevi iPSCs korumak T hücresi kaynaklı iPSCs korunabilirve insan ve insan iPSCs EKH aynı teknikler kullanılarak muhafaza edilmiştir. IPSC kolonileri büyümek kez aynı prosedürü tekrar ederek büyük yemeklerin içine genişletin. Her 1-2 gün mTeSR orta değiştirin. Koloniler Konfluent hale geldiğinde her 5-7 gün, insan iPSCs ve üreticinin talimatlarına göre insan EKH için ayrılma çözümü kullanarak geçiş hücreleri.