Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

1. Prepare activadas las células T humanas Recoger 10 ml de sangre entera heparinizada de un donante por punción venosa. Obtener el consentimiento informado de los donantes antes de la punción venosa. Venopunción debe ser realizado por personal calificado y entrenado. Maneje las muestras de sangre obtenidas con material estéril y siguientes pautas de bioseguridad adecuadas. Diluir 10 ml de sangre entera heparinizada con 10 ml D-PBS (-). Poner 15 ml de solución de Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Capa de la solución de sangre 20-ml preparado en el Paso 1.2 en la solución Ficoll en el paso 1.3. Utilizando una pipeta eléctrica, dejó solución de sangre preparada en el Paso 1.2 run lentamente a lo largo de la pared interior del tubo. Tenga cuidado de no mezclar la solución de sangre y una solución de Ficoll. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a TA. Ajuste la velocidad de deceleración centrífuga para "lento". Nota: Después de la centrifugación, una fina blancacapa emerge entre una capa de plasma lechosa superior y una capa inferior de Ficoll clara. Esta fina capa blanca contiene las células mononucleares. Transferir la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 ml con una pipeta de 1 ml. Tenga cuidado de no incluir la solución de Ficoll. Añadir D-PBS (-) a las células mononucleares a un volumen total de 10 ml, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA. Eliminar el sobrenadante. Añadir 10 ml de D-PBS (-) a las células mononucleares, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA. Descartar el sobrenadante, añadir 1 ml de medio KBM502 a las células mononucleares recogidas, y contar las células utilizando un hemocitómetro. Más de 5 × 10 6 células mononucleares se pueden obtener a partir de 10 ml de sangre entera heparinizada con la separación apropiada utilizando Ficoll. Preparar una solución de anticuerpo anti-CD3 humano a una concentración de 10 mg / ml en D-PBS (-). Añadir la solución de anticuerpo anti-CD3 humano a una placa de 6 pocillos, remoje las olasas de cada pocillo y se incuba la placa a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante al menos 30 minutos. Retirar la solución de anticuerpo anti-CD3 humano de cada pocillo y lavar una vez con D-PBS (-) justo antes de la siembra de las células. Células mononucleares de la semilla que se prepararon en el Paso 1.9 a una densidad de 2,5 x 10 5 células / cm 2 en las anti-CD3 humano placas de 6 pocillos recubiertas de anticuerpo en medio KBM502. Se incuba a 37 ° C en un 5% CO 2 incubadora durante 3-7 días sin cambio medio hasta que las células T alcanzan la confluencia. Células T en este período son ambas células suspendidas y adheridos. 2. Infect T humanas Las células con SeV Vectores Después de 3-7 días de cultivo, recoger las células T activadas con medio existente con la pipeta. Ellos Transferir a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min a TA. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio KBM502 fresco. Contar las células y la placa 1.5 × 10 6 células (en 2 ml de medio KBM502 fresca) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos recubiertos con anticuerpos anti-CD3. Descongele las soluciones SeV de OCT3 / 4-SEV / TSΔF, Sox2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, y c-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF en hielo. Añadir las soluciones que contienen SeV OCT3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, y c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF individualmente a los pocillos, cada uno a una multiplicidad de infección (MOI) 10. Incubar a 37 ° C en un 5% CO 2 incubadora durante 24 horas más. 3. Retire Vectores SeV de células T humanas 24 horas después de la infección, recoger las células infectadas con una pipeta. Si hay células adheridas, que fácilmente se pueden separar pipetear repetidamente hacia arriba y abajo. Ellos Transferir a un tubo cónico de 15 ml, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA. Eliminar el sobrenadante que contiene los vectores SeV, y añadir 2 ml de medio KBM502 fresco. Células Replate en each de los pocillos. Se incuba a 37 ° C en un 5% CO 2 incubadora para un 24 h adicionales. 4. Las células reseed en una capa de Matrigel Prepare la solución de matriz de membrana basal por gel de matriz de descongelación (consulte la Lista de materiales para la marca específica utilizada en este estudio) a 4 ° C y la disolución de 0,2 ml en 10 ml de medio DMEM / F12. Nota: Gel Matrix (por favor ver la Lista de materiales para la marca específica utilizada en este estudio) tiene que descongelar O / N a 4 ° C para ser completamente descongelado. Guárdelo en hielo hasta justo antes de su uso. Placa de disolución de la matriz de la membrana basal 5 ml por plato en platos de 100 mm y dejar a temperatura ambiente durante al menos 30 min antes de la siembra de células. Se necesitan al menos dos platos de 100 mm para un experimento. Recoger las células infectadas por SeV mediante pipeteo, transferirlos a un tubo cónico de 15 ml, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio KBM502 fresco. Cuente el número de ceLLS utilizando un hemocitómetro, eliminar la solución de matriz de membrana basal de 100 mm de platos preparados en la etapa 4.2 y la placa de 1 × 10 5 y 1 × 10 6 células (en 10 ml de medio mTeSR fresco) en un 100-mm de la membrana basal de la matriz revestida platos. Por último, utilice la placa en la que las colonias se recogen fácilmente. Incubar la placa a 37 ° C en un 5% CO 2 incubadora O / N. Cambie el medio de 10 ml carne medio mTeSR cada dos días. Nota: Aproximadamente 20 a 30 días después de la infección, colonias que se parecen mucho a las células madre embrionarias (CES) aparecerá. 5. Ampliar T iPSCs derivada de células- Prepare la solución de matriz de membrana basal por gel de matriz de descongelación (consulte la Lista de materiales para la marca específica utilizada en este estudio) a 4 ° C y la disolución de 0,2 ml en 10 ml de medio DMEM / F12. Placa 1 ml de la solución de matriz de membrana basal por pocillo en una placa de 6 pocillos y dejar a temperatura ambiente durante por lomenos 30 minutos antes de recoger colonias. Llenar una placa de 96 pocillos con 20 l de medio mTeSR por pocillo. Seleccione colonias que se asemejan a los CES bajo el microscopio estereoscópico con una pipeta 20 l. Nota: Las colonias de los CES y CMPI son redondos y plana como se muestra en la Figura 1B. Transferencia colonias seleccionadas en la placa de 96 pocillos con medio lleno mTeSR en el Paso 5.3. Añadir 200 l de medio mTeSR a cada pocillo y cuidadosamente pipeta arriba y hacia abajo para romper la colonia en pequeños grupos bajo el microscopio estereoscópico con una pipeta 200 l. Eliminar la solución de matriz de membrana basal de la bien preparada en 5,2 y poner cada colonia en un pocillo de la placa de 6 pocillos matriz recubiertos membrana basal con 2 ml de medio mTeSR por pocillo. Cambie el medio de 2 ml carne medio mTeSR cada dos días. 6. Mantener T iPSCs derivada de células- Las células iPS derivadas de células T pueden ser mantenidosy almacenados usando las mismas técnicas que para iPSCs humanos y los CES humanos. Una vez colonias IPSC crecen, ampliarlos en platos grandes repitiendo el mismo procedimiento. Cambie el medio mTeSR cada 1-2 días. Cuando las colonias se hacen confluentes cada 5-7 días, el paso de las células utilizando solución de disociación para iPSCs humanos y los CES humanos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.