Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

1. Prepare células T humanas activadas Colete 10 ml de sangue total heparinizado de um doador por punção venosa. Obter o consentimento informado dos doadores antes da punção venosa. Punção venosa deve ser feita por pessoal qualificado e treinado. Lidar com amostras de sangue obtidas com equipamentos esterilizados e seguintes diretrizes de biossegurança adequadas. Dilui-se 10 ml de sangue total heparinizado com 10 ml de D-PBS (-). Colocar 15 ml de Ficoll solução (prémio de Ficoll-Paque) para um novo tubo cónico de 50 ml. Camada da solução de sangue de 20 ml, preparada na etapa 1.2 para a solução de Ficoll no passo 1.3. Usando uma pipeta elétrica, deixe a solução de sangue preparada no Passo 1.2 funcionar lentamente ao longo da parede interior do tubo. Tenha cuidado para não misturar a solução de sangue e solução de Ficoll. Centrifuga-se a 400 x g durante 30 min à TA. Defina a velocidade de desaceleração centrífuga para "lento". Nota: Após a centrifugação, uma fina brancocamada surge entre uma camada de plasma leitoso superior e uma camada inferior Ficoll clara. Esta fina camada branca contém células mononucleares. Transferir a camada de células mononucleares para um novo tubo cónico de 50 ml com uma pipeta de 1 ml. Tenha cuidado para não incluir solução Ficoll. Adicionar D-PBS (-) para as células mononucleares a um volume total de 10 ml, e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. Desprezar o sobrenadante. Adicionar 10 ml de D-PBS (-) para as células mononucleares, e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 ml de meio KBM502 para as células mononucleares coletadas, e contar as células utilizando um hemocitómetro. Mais de 5 x 10 6 células mononucleares pode ser obtido a partir de 10 ml de sangue total heparinizado com separação apropriada usando Ficoll. Prepara-se uma solução de anticorpo anti-CD3 humano a uma concentração de 10 ug / ml em D-PBS (-). Adicionar a solução de anticorpo anti-CD3 humano de uma placa de 6 poços, embeber a ressacaás de cada poço, e a incubação do prato a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 durante pelo menos 30 min. Remover a solução de anticorpo CD3 anti-humano a partir de cada cavidade e lavar uma vez com D-PBS (-) imediatamente antes de semear as células. Células mononucleares de semente que foram preparados no passo 1.9, a uma densidade de 2,5 x 10 5 células / cm2 sobre o anti-CD3 humana revestidas com anticorpo placas de 6 poços em meio de KBM502. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante 3-7 dias, sem mudança de meio, as células T até a confluência. As células T neste período são as duas células em suspensão e aderentes. 2. As células T humanas Infect com SEV Vetores Depois de 3-7 dias de cultura, recolher as células T ativadas com meio existente por pipetagem. Transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco KBM502. Contar as células e placa 1.5 x 10 6 células (em 2 ml de meio fresco KBM502) em cada poço de um anti-CD3 anticorpo revestidos por placa de 6 poços. Descongele as soluções de OCT3 SEV / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, e c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF no gelo. Adicionar as soluções contendo OCT3 Sev / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, e c-Myc (LCF) -SeV / TS15ΔF individualmente para os poços, cada um com uma multiplicidade de infecção (MOI) 10. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante mais 24 horas. 3. Retire Vetores SEV de células T humanas 24 h após a infecção, as células infectadas recolha com uma pipeta. Se houver células aderentes, eles podem facilmente ser destacado pipetando-los várias vezes para cima e para baixo. Transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. Remover o sobrenadante contendo os vetores SEV, e adicionar 2 ml de meio KBM502 fresco. Células replate em each dos poços. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante mais 24 horas adicionais. 4. RESEED células em uma camada Matrigel Preparar a solução matriz da membrana basal por gel matriz descongelação (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) a 4 ° C e dissolvendo 0,2 ml em 10 ml de meio DMEM / F12. Nota: gel Matrix (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) precisa descongelar O / N a 4 ° C para ser totalmente descongelado. Mantenha-o em gelo até imediatamente antes da utilização. Placa 5 ml de solução de matriz da membrana basal por placa em placas de 100 mm e deixar à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min antes da sementeira de células. Pelo menos duas placas de 100 mm são necessários para um experimento. Recolhe células SEV-infectados por pipetagem, transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco KBM502. Contar o número de cells usando um hemocitômetro, remova a solução de matriz da membrana basal de pratos de 100 mm preparado no passo 4.2 e placa 1 × 10 5 e 1 × 10 6 células (em 10 ml de meio mTeSR fresco) em uma de 100 mm membrana basal matriz revestido pratos. Finalmente, use a placa em que as colônias são facilmente colhidas. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora S / N. Mude a médio e 10 ml carne médio mTeSR a cada dois dias. Nota: Aproximadamente 20-30 dias após a infecção, colônias que se assemelham células-tronco embrionárias (CES) aparecerá. 5. Expanda T iPSCs derivadas de células Preparar a solução matriz da membrana basal por gel matriz descongelação (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) a 4 ° C e dissolvendo 0,2 ml em 10 ml de meio DMEM / F12. Placa 1 ml da solução de matriz da membrana basal por poço numa placa de 6 poços e deixar à temperatura ambiente durante amenos 30 minutos antes de escolher colônias. Encha uma placa de 96 poços com 20 ul de meio por poço mTeSR. Selecione colônias que se assemelham a CES sob o microscópio estereoscópico com uma pipeta de 20 mL. Nota: As colônias do CES e iPSCs são redondos e lisos como mostrado na Figura 1B. Transferência de colónias seleccionadas para a placa de 96 poços preenchidos com meio mTeSR no passo 5.3. Adicionar 200 ul de meio mTeSR a cada poço e cuidadosamente pipetar para cima e para baixo para quebrar a colónia em pequenos torrões, ao microscópio estereoscópico, utilizando uma pipeta de 200 uL. Remover a solução de matriz de membrana basal preparado a partir do poço de 5,2 e colocar cada colónia para um poço da membrana basal revestida de matriz de 6 poços da placa com 2 ml de meio por poço mTeSR. Mude a médio e 2 ml carne médio mTeSR a cada dois dias. 6. Manter T iPSCs derivadas de células Os iPSCs derivadas de células T pode ser mantidae armazenadas usando as mesmas técnicas que para iPSCs humanos e CES humanos. Uma vez colónias IPSC crescer, expandir-los em pratos maiores, repetindo o mesmo procedimento. Mudar o meio mTeSR a cada 1-2 dias. Quando as colónias tornam-se confluentes a cada 5-7 dias, a passagem das células, utilizando uma solução de dissociação para iPSCs humanos e CES humanos de acordo com as instruções do fabricante.