Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder

1. Preparare cellule T attivate umana Raccogliere 10 ml di sangue intero eparinizzati da un donatore mediante prelievo venoso. Ottenere il consenso informato dei donatori in anticipo di prelievo venoso. Venipuntura deve essere effettuata da personale qualificato ed addestrato. Maneggiare i campioni di sangue ottenuti con materiale sterile e seguenti linee guida di biosicurezza adeguate. Diluire 10 ml di sangue intero eparinizzati con 10 ml D-PBS (-). Mettere 15 ml di soluzione di Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) in un nuovo tubo conico da 50 ml. Strato la soluzione di sangue da 20 ml preparata al punto 1.2 sulla soluzione di Ficoll al punto 1.3. L'utilizzo di un pipetta elettrico, della soluzione di sangue preparata al punto 1.2 correre lentamente lungo la parete interna del tubo. Fare attenzione a non mescolare la soluzione di sangue e la soluzione Ficoll. Centrifugare a 400 xg per 30 minuti a RT. Impostare la velocità di decelerazione centrifuga per "lento". Nota: Dopo la centrifugazione, un bianco sottilestrato emerge tra uno strato di plasma lattiginoso superiore e uno strato di Ficoll bassa chiara. Questo strato sottile bianca contiene cellule mononucleate. Trasferire lo strato di cellule mononucleate in una nuova provetta conica da 50 ml con una pipetta 1 ml. Fare attenzione a non includere la soluzione di Ficoll. Aggiungere D-PBS (-) per le cellule mononucleate ad un volume totale di 10 ml e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Aggiungere 10 ml di D-PBS (-) alle cellule mononucleari, e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante, aggiungere 1 ml di KBM502 medio per le cellule mononucleate raccolti, e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Oltre 5 × 10 6 cellule mononucleari possono essere ottenuti da 10 ml di sangue intero eparinizzati con separazione appropriato utilizzando Ficoll. Preparare una soluzione di anticorpo CD3 anti-umano ad una concentrazione di 10 ug / ml in PBS-D (-). Aggiungere la soluzione di anticorpi anti-CD3 umana a una 6-pozzetti, immergere il surfasso di ogni pozzetto e incubare il piatto a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per almeno 30 min. Rimuovere la soluzione di anticorpi CD3 anti-umano da ciascun pozzetto e lavare una volta con PBS-D (-) appena prima semina delle cellule. Cellule mononucleate Seed che sono stati preparati nel passo 1.9 ad una densità di 2,5 x 10 5 cellule / cm 2 sui CD3 antiumano 6 pozzetti rivestiti con anticorpo in KBM502 media. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per 3-7 giorni senza mezzo di cambiamento fino a quando le cellule T raggiungono confluenza. Le cellule T in questo periodo sono sia le cellule in sospensione e aderenti. 2. Infettare T umano Celle con SEV Vettori Dopo 3-7 giorni la cultura, raccogliere le cellule T attivate con medio esistente pipettando. Trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di mezzo KBM502 fresco. Contare le cellule e la piastra 1.5 × 10 6 celle (in 2 ml di media KBM502 fresco) in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti anti-CD3 anticorpo-rivestito. Scongelare le soluzioni SEV di Oct3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, Klf4-SEV / TSΔF, e c-Myc (HNL) -sev / TS15ΔF sul ghiaccio. Aggiungere le soluzioni SEV contenenti Oct3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, Klf4-SEV / TSΔF, e c-Myc (HNL) -sev / TS15ΔF individualmente ai pozzi, ciascuna ad una molteplicità di infezione (MOI) 10. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per altre 24 ore. 3. Rimuovere Sev Vettori da T cellule umane 24 ore dopo l'infezione, raccogliere le cellule infettate con una pipetta. Se ci sono cellule aderenti, possono facilmente essere staccati li pipettando ripetutamente su e giù. Trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante contenente i vettori Sev, e aggiungere 2 ml di mezzo KBM502 fresco. Cellule replate a each dei pozzetti. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per altre 24 ore. 4. Cellule reseed su uno strato Matrigel Preparare la soluzione di matrice membrana basale da gel matrice scongelamento (si veda l'elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) a 4 ° C e sciogliendo 0,2 ml in 10 ml di terreno DMEM / F12. Nota: Gel Matrix (si veda l'elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) deve scongelare O / N a 4 ° C per essere completamente scongelati. Tenerlo in ghiaccio fino al momento dell'uso. Piatto soluzione matrice membrana basale 5 ml per piastra in piastre da 100 mm e lasciare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima della semina cellule. Almeno due piatti da 100 mm sono necessari per un esperimento. Raccogliere le cellule SEV-infettate pipettando, trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di mezzo KBM502 fresco. Contare il numero di cells con un emocitometro, rimuovere la soluzione di matrice membrana basale da piatti da 100 mm preparati nel passaggio 4.2 e piastra 1 × 10 5 e 1 × 10 6 celle (in 10 ml di media mTeSR fresco) su un 100 mm membrana basale matrice rivestita piatti. Infine, utilizzare la piastra in cui le colonie sono facilmente raccolti. Incubare il piatto a 37 ° C in 5% -CO 2 incubatore O / N. Cambiare il medio 10 ml di incarnarsi mTeSR medio a giorni alterni. Nota: Circa 20-30 giorni dopo l'infezione, colonie che ricordano da vicino le cellule staminali embrionali (ESC) apparirà. 5. Espandere T iPSCs derivati ​​dalle cellule Preparare la soluzione di matrice membrana basale da gel matrice scongelamento (si veda l'elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) a 4 ° C e sciogliendo 0,2 ml in 10 ml di terreno DMEM / F12. Piastra 1 ml di soluzione di matrice membrana basale per bene in un 6-pozzetti e lasciare a temperatura ambiente per un periodoalmeno 30 minuti prima di prendere colonie. Riempire una piastra a 96 pozzetti con 20 ml di mTeSR media per pozzetto. Selezionare colonie che assomigliano CES allo stereomicroscopio con una pipetta 20 ml. Nota: Le colonie di CES e iPSCs sono rotondi e piatta come mostrato in Figura 1B. Trasferire colonie selezionate nella piastra a 96 pozzetti pieni di mTeSR medie punto 5.3. Aggiungere 200 ml di mTeSR media ad ogni bene e con attenzione pipetta su e giù per rompere la colonia in piccoli ciuffi con lo stereomicroscopio con una pipetta 200 l. Rimuovere la soluzione di matrice membrana basale dalla ben preparato in 5.2 e mettere ogni colonia in un pozzetto della membrana basale matrice rivestite 6 pozzetti con 2 ml di mTeSR media per pozzetto. Cambiare il medio-2 ml di incarnarsi mTeSR medio a giorni alterni. 6. Mantenere T iPSCs derivati ​​dalle cellule Le iPSCs derivati ​​dalle cellule T possono essere mantenutie memorizzati utilizzando le stesse tecniche per iPSCs umane e CES umani. Una volta che le colonie IPSC crescono, li espandersi in piatti più grandi ripetendo la stessa procedura. Cambia il mezzo mTeSR ogni 1-2 giorni. Quando le colonie diventano confluenti ogni 5-7 giorni, di passaggio le cellule utilizzando soluzione dissociazione per iPSCs umani e CES umani in base alle istruzioni del produttore.