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Developmental Biology

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Published: November 11, 2015
doi:
10.3791/53225
, , , ,
1Department of Cardiology,Keio University School of Medicine, 2Department of Emergency and Critical Care Medicine,Keio University School of Medicine

Summary

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

Abstract

Vor kurzem haben iPSCs Aufmerksamkeit als neue Quelle von Zellen für regenerative Therapien angezogen. Obwohl die ursprüngliche Verfahren zum Erzeugen iPSCs angeführten dermalen Fibroblasten durch invasive Biopsie und retrovirale genomische Insertion von Transgenen erhalten wird, hat es viele Bemühungen, diese Nachteile zu vermeiden. Menschliche periphere T-Zellen sind eine einzigartige Zellquelle zur Erzeugung von iPS-Zellen. iPSCs aus T-Zellen abgeleitet sind Neuanordnungen der T-Zell-Rezeptor (TCR) Gene und sind eine Quelle von Antigen-spezifischen T-Zellen. Zusätzlich haben die T-Zell-Rezeptor-Umlagerung in das Genom hat das Potential, einzelnen Zelllinien zu markieren und eine Unterscheidung zwischen transplantierten und Spenderzellen. Zum sicheren klinischen Anwendung iPSCs, ist es wichtig, um die Gefahr des Freilegens neu erzeugten iPSCs schädliche Mittel zu minimieren. Obwohl fötalem Rinderserum und Feeder-Zellen wurden wesentlich für pluripotente Stammzellen in Kultur ist es bevorzugt, sie aus dem Kultursystem zu entfernen, um das Risiko zu verringernunvorhersehbarer Pathogenität. Zur Lösung dieses Problems haben wir ein Protokoll zur Erzeugung iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen unter Verwendung von Sendai-Virus, um das Risiko der Freigabe iPSCs undefinierte Pathogene reduzieren etabliert. Obwohl Umgang mit Sendai-Virus erfordert Geräte mit der entsprechenden Sicherheitsstufe, aktiviert Sendai Virus infiziert T-Zellen ohne Genom Insertion, noch mit hohem Wirkungsgrad. In diesem Protokoll zeigen wir die Erzeugung von iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen in Feeder freien Bedingungen mit einer Kombination von aktivierten T-Zellkultur und Sendai-Virus.

Introduction

iPSCs haben beträchtliche Aufmerksamkeit als eine bahnbrechende Quelle von Zellen für die regenerative Medizin 1-3 angezogen. Bisher wurden verschiedene Methoden zur Erzeugung iPSCs wurde berichtet 4,5. Unter diesen haben iPSCs von menschlichen T-Zellen erzeugt von besonderem Interesse wegen der weniger invasiven Verfahren des Zellprobenahme 6-8 gewesen. Zusätzlich iPSCs von T-Zellen abgeleitet sind Neuanordnungen der T-Zell-Rezeptor (TCR) Gen und sind daher eine Quelle von Antigen-spezifischen T-Zellen 9,10. Daher Erzeugung T-Zell-abgeleiteten iPSCs sicher ist nützlich zur fortschreitenden regenerativen Medizin.

Dieses Verfahren basiert auf dem Konzept der Verringerung der Gefahr von unvorhersehbaren Pathogenität basiert. Zum sicheren klinischen Anwendung iPSCs ist es wichtig, um das Risiko der Exposition gegenüber Pathogenen 11 zu reduzieren. Zuvor in vielen Kultursystemen pluripotenter Stammzellen haben fötalem Rinderserum und Feeder-Zellen als wesentliche Reagenzien verwendetS12. Jedoch ist die Entfernung dieser beiden Reagenzien aus dem Kultursystem bevorzugt iPSC Generation, das Risiko von unvorhersehbaren Pathogenität zu reduzieren.

Zusätzlich hat dieses Verfahren den Vorteil, daß eine invasive Zellprobenahme von Patienten und mühsame Herstellung von feeder-Zellen. Da T-Zell-abgeleiteten iPSCs wurden bereits erfolgreich in Forschungs 13,14 verwendet wurde, ist dieses Verfahren ebenfalls anwendbar und nützlich für die Erzeugung krankheitsspezifische iPSCs von Patienten.

Unter T Reprogrammierung Verfahren unter Verwendung des Sendai-Virus (SeV) Vektor als ein Gen Fahrzeug ist ein Verfahren, das mit hoher Effizienz iPSCs 7,16 generieren kann. Darüber hinaus, da SeV ist ein Einzelstrang-RNA-Virus und keine DNA-Phase für die Replikation benötigen, die Nutzung im iPSC Generation vermeidet das Brechen des Wirtsgenom 17-19. Daher haben wir Protokolle zur Erzeugung iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen in serum fr festee und Feeder-freien Bedingungen mit einer Kombination von Matrigel mTeSR Medium und SeV Vektoren.

Protocol

1. Bereiten Sie aktivierten humanen T-Zellen Sammeln Sie 10 ml heparinisiertes Vollblut von einem Spender durch Venenpunktion. Erhalten informierte Zustimmung der Spender vor der Venenpunktion. Venenpunktion müssen von qualifiziertem und geschultem Personal durchgeführt werden. Griff Blutproben mit steriler Ausrüstung und nach entsprechender Biosicherheit Richtlinien. Verdünnen von 10 ml heparinisiertes Vollblut mit 10 ml D-PBS (-). Setzen 15 ml Ficoll-Lösung (Ficoll-Paque PREMIUM) in ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Schicht die 20-ml Blutlösung in Schritt 1.2 auf die Ficoll-Lösung in Schritt 1.3 vorbereitet. Mit einem elektrischen Pipette, lassen Sie Blutlösung in Schritt 1.2 laufen langsam entlang der Innenwand der Röhre hergestellt. Achten Sie darauf, das Blut-Lösung und Ficoll Lösung zu mischen. Zentrifuge bei 400xg 30 min bei RT. Stellen Sie die Schleuderverzögerungsgeschwindigkeit auf "langsam". Hinweis: Nach der Zentrifugation eine weiße dünneSchicht entsteht zwischen einer oberen milchig Plasmaschicht und eine untere klare Ficoll-Schicht. Dieser weiße dünne Schicht enthält mononuklearen Zellen. Übertragung der mononuklearen Zellschicht in ein neues 50 ml konischen Röhrchen mit einer 1-ml-Pipette. Achten Sie darauf, Ficoll-Lösung enthalten. Hinzufügen D-PBS (-) zu den mononuklearen Zellen auf ein Gesamtvolumen von 10 ml und Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei RT. Überstand verwerfen. 10 ml D-PBS (-) zu den mononuklearen Zellen und Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei RT. Überstand verwerfen, 1 ml KBM502 Medium, um den gesammelten mononuklearen Zellen, und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Mehr als 5 x 10 6 mononuklearen Zellen aus 10 ml heparinisiertem Vollblut mit angemessene Trennung unter Verwendung von Ficoll gewonnen werden. Vorbereitung eines Anti-Mensch CD3-Antikörper-Lösung mit einer Konzentration von 10 ug / ml in D-PBS (-). Fügen Sie den Anti-Mensch-CD3-Antikörper-Lösung zu einer 6-Well-Platte, genießen die BrandungAss jede Vertiefung und inkubieren Sie die Schale bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für mindestens 30 min. Entfernen Sie den Anti-Mensch-CD3-Antikörper-Lösung aus jeder Vertiefung und einmal mit D-PBS waschen (-) unmittelbar vor der Aussaat der Zellen. Samen mononukleären Zellen, die in Schritt 1,9 bei einer Dichte von 2,5 × 10 5 Zellen / cm 2 an den Anti-Human-CD3-Antikörper-beschichtete Platten mit 6 Vertiefungen in KBM502 Medium hergestellt wurden. Bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 3-7 Tage ohne Mediumwechsel, bis die T-Zellen Konfluenz erreichen. T-Zellen in dieser Zeit sind beide suspendiert und adhärenten Zellen. 2. Infect menschlichen T-Zellen mit SeV Vektoren Nach 3-7 Tagen Kultur, sammeln die aktivierten T-Zellen mit den bestehenden Medium durch Pipettieren. Übertragung auf einen 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und 1 ml frisches KBM502 Medium. Zählen Sie die Zellen und die Platte 1.5 × 10 6 Zellen (in 2 ml frisches Medium KBM502) in jede Vertiefung eines Anti-CD3-Antikörper-beschichteten 6-Well-Platte. Auftauen SEV Lösungen OCT3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF und c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF auf Eis. Fügen Sie die SeV Lösungen, die OCT3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF und c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF einzeln in die Vertiefungen, die jeweils bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) 10. Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% -CO 2 -Inkubator für weitere 24 hr. 3. Entfernen Sie SeV Vektoren von menschlichen T-Zellen 24 Stunden nach der Infektion, sammeln Sie die infizierten Zellen mit einer Pipette. Wenn es anhaftenden Zellen, können sie leicht abgenommen Pipettieren von ihnen mehrmals nach oben und unten ist. Übertragung auf einen 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min bei RT. Entfernen Sie die Überstand, der die SeV-Vektoren und 2 ml frischem KBM502 Medium. Ausstrich Zellen in each der Vertiefungen. Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% -CO 2 -Inkubator für zusätzliche 24 Std. 4. Reseed Cells auf einem Matrigel Schicht Bereiten Basalmembranmatrix Lösung durch Auftauen Matrix-Gel (finden Sie in der Materialliste für die jeweilige Marke in dieser Studie verwendet) bei 4 ° C und Auflösen von 0,2 ml in 10 ml DMEM / F12-Medium. Hinweis: Matrix-Gel (finden Sie in der Materialliste für die jeweilige Marke in dieser Studie verwendet) muss O / N bei 4 ° C aufgetaut, um vollständig aufgetaut werden. Halten Sie es auf Eis, bis kurz vor der Verwendung. Platte 5 ml Basalmembranmatrix Lösung pro Schale in 100 mm-Schalen und lassen bei RT für mindestens 30 min vor der Aussaat Zellen. Mindestens zwei 100-mm-Schalen werden für ein Experiment benötigt wird. Sammeln SeV-infizierten Zellen durch Pipettieren, Übertragung auf einen 15-ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. Entfernen Sie den Überstand und 1 ml frisches KBM502 Medium. Zählen Sie die Anzahl der cells mit einer Zählkammer, entfernen Sie die Basalmembran-Matrix-Lösung von 100-mm-Schalen in Schritt 4.2 und platte 1 × 10 5 und 1 × 10 6 Zellen (in 10 ml frischem mTeSR mittel) auf einem 100-mm Basalmembranmatrix beschichtet Geschirr. Schließlich verwenden Sie die Platte, in der Kolonien werden leicht aufgenommen. Inkubieren der Schale bei 37 ° C in einem 5% -CO 2 -Inkubator O / N. Ändern Sie das Medium auf 10 ml Medium mTeSR Fleisch jeden zweiten Tag. Hinweis: ca. 20-30 Tage nach der Infektion, Kolonien, die sehr ähnlich sind embryonale Stammzellen (ESC) wird angezeigt. 5. Erweitern Sie T-Zellen abgeleiteten iPSCs Bereiten Basalmembranmatrix Lösung durch Auftauen Matrix-Gel (finden Sie in der Materialliste für die jeweilige Marke in dieser Studie verwendet) bei 4 ° C und Auflösen von 0,2 ml in 10 ml DMEM / F12-Medium. Platte 1 ml der Basalmembran Matrixlösung pro Well in einer 6-Well-Platte und lassen bei RT für zuminmindestens 30 min vor Kommissionierung Kolonien. Füllen Sie einen 96-Loch-Platte mit 20 ul mTeSR Medium pro Vertiefung. Wählen Kolonien, die Wirtschafts- und Sozialräte unter dem Stereomikroskop mit einer 20 & mgr; l-Pipette ähneln. Hinweis: Die Kolonien der WSR und iPSCs sind rund und flach, wie in 1B gezeigt. Transfer ausgewählten Kolonien in die 96-Lochplatte mit mTeSR Medium in Schritt 5.3 gefüllt. Fügen Sie 200 ul mTeSR Medium in jede Vertiefung pipettieren und vorsichtig nach oben und unten, um die Kolonie zu kleinen Klumpen unter dem Stereomikroskop mit einer 200 ul Pipetten brechen. Entfernen Sie die Basalmembran-Matrix-Lösung aus dem gut vorbereitet in 5.2 und legte jede Kolonie in eine Vertiefung der Basalmembran-Matrix beschichteten 6-Well-Platte mit 2 ml mTeSR Medium pro Vertiefung. Ändern Sie den mittleren bis 2 ml mTeSR Medium Fleisch jeden zweiten Tag. 6. Pflegen Sie T-Zellen abgeleiteten iPSCs Die T-Zellen abgeleiteten iPSCs aufrechterhalten werden kannund gespeichert mit den gleichen Techniken wie für den menschlichen iPS-Zellen und menschlichen WSR. Sobald iPSC Kolonien heranwachsen, erweitern sie in größere Gerichte Wiederholung des gleichen Verfahrens. Ändern Sie den mTeSR Medium alle 1-2 Tage. Wenn die Kolonien konfluent werden alle 5-7 Tage, Durchgang die Zellen unter Verwendung Dissoziationslösung für den menschlichen iPS-Zellen und menschlichen Wirtschafts- und Sozialräte gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Representative Results

Unter Verwendung dieses Protokolls können Benutzer iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen in stabiler Weise zu erzeugen. iPSC Erzeugung von T-Zellen mit SeV und Matrigel zeigte etwa 0,002%. – 0,005% der Effizienz der Reprogrammierung zwischen mehreren Geber Fälle und SeV wurden nach mehreren Passagen nicht erkannt 16 1A zeigt eine schematische Darstellung des Protokoll zur Erzeugung von T-Zellen abgeleiteten iPSCs in Feeder freien Bedingungen unter Verwendung von Matrigel und mTeSR Medium. Ca. 20-30 Tage nach Infektion mit SeV werden iPSC Kolonien von ihren ESC-Kolonie-Morphologie (Abbildung 1B) anerkannt. Immunfluoreszenzfärbung zeigte die Expression von typischen pluripotenten Zellmarker (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 und TRA-1-81) in T-Zell-abgeleitete iPSCs erzeugt unter Zuführung freien Bedingungen (Abbildung 1c). "Breite =" 700 "/> Figur 1 (A): Ein Schema des Protokolls für eine Neuprogrammierung T-Zellen unter Zuführung freien Bedingungen in dieser Studie. (B): Eine typische ESC-ähnliche iPSC Kolonie an Tag 27 nach der Blutentnahme unter Zuführung freien Bedingungen. (C): ALP-Färbung und Immunfluoreszenzfärbung für Pluripotenz und Oberflächenmarker (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 und TRA-1-81) in T-Zell-abgeleitete iPSCs erzeugt unter Zuführung freien Bedingungen. Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

We describe a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells in serum-free and feeder-free conditions using a combination of matrigel, mTeSR medium, and SeV vectors. For clinical applications of iPSCs, it is important to have a protocol for stably generating iPSCs and a less-invasive method for cell sampling. Although generating iPSCs with the combination of matrigel and mTeSR medium showed lower reprogramming efficiency than that with knockout serum replacement (KSR) medium and feeder-cells, this combination achieves stable generation of iPSCs from donors16. Stable iPSC generation and less-invasive cell sampling has the advantage of being able to increase the number of donors for iPSC generation.

SeV vectors, a minus-strand RNA virus, is not integrated into the host genome. Therefore the risks of tumorigenesis can be avoided at the step of reprogramming factor induction20-24. Additionally, the feeder-free conditions, which use a combination of defined culture medium and matrigel instead of a feeder layer, make it possible to minimize the potential risks of exposure to unknown exogenous factors. The fusion of these techniques provides a less invasive and safer iPSC technology for regenerative medicine16.

Important steps in this protocol are the step of activating human T cells (Step 1) and infecting them with SeV vectors (Step 2). When no ESC-like colony is obtained in the culture dish at an optimal time after SeV infection, the following should be considered. First, the confluency of the mononuclear cells before T cell activation may not be appropriate because optimal activation of T cells is critical for SeV infection25,26. Too high a density of mononuclear cells leads to cell death, interfering with the proper activation of T cells. Too low a density of mononuclear cells also disturbs the proper activation and proliferation of T cells. Therefore, the confluency of mononuclear cells should be checked and adjusted accordingly. Second, the dosage of SeV vectors may not be sufficient. The induction efficiency of iPSC colonies depends on the dosage of the virus6. If no ESC-like colony is observed after SeV infection, the option of increasing the virus dosage up to an MOI of 15-20 should be considered. If signs of iPSC colony differentiation are observed, the frequency at which medium is changed may be increased up to every other day, or to every day when colonies are larger.

The limitation in this protocol consists of this method not being virus free. Although SeV for cell reprogramming is commercially available with ease, users need to prepare equipment according to the appropriate biosafety level. As another method for generating integration-free iPSCs, episomal vectors have been used until now27-29. Although episomal vectors can be used with equipment with a lower level of biosafety, episomal vectors might insert into the host genome at extremely low rates. Therefore, additional checks are required to confirm the disappearance of transgenes, as when using SeV.

There is another limitation in that this technique is not absolutely free from animal-derived products. Some substrates, such as matrigel, anti-CD3 mAb, dissociation solution and SeV solution are derived from animal products and are therefore associated with a risk of transferring xenogeneic pathogens. However, the reduction of animal-derived substrates in the culture system is meaningful for the clinical application of iPSC technology due to the lower risk.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir bedanken uns bei Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi und Rei Ohno von der Keio University School of Medicine, um technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen R & D Systems Support-Programm, um die praktische Nutzung von Gesundheitsforschungsergebnissen zu beschleunigen, und die Autobahn-Programm für die Realisierung von regenerativen Medizin gefördert.

Materials

Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare 17-5442-02
Purified NA/LE mouse anti-human CD3 BD Pharmingen 555336
KBM502 medium KOHJIN BIO 16025020 Warm in 37 ℃ water bath before use
Bovine albumin fraction V solution Gibco 15260-037
BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced BD Biosciences 354230 Thaw completely at 4℃ overnight and dilute it 50 times with Dulbecco's Modified Eagle's Medium before coating culture dishes
mTeSR1 medium kit STEM CELL 5850 Warm at room temperature before use
Dissociation Solution ReproCELL RCHETP002
D-PBS(–) Wako 045-29795
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 DNAVEC DV-0303c Thaw on ice before use
100-mm tissue culture dish Falcon 353003
96-well tissue culture plate Falcon 353078
6-well tissue culture plate Falcon 353046
15ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One  188271
50ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One  227261
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References

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Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions. J. Vis. Exp. (105), e53225, doi:10.3791/53225 (2015).
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