Использование конфокальной Анализ<em> Xenopus Laevis</em> По расследованию модуляторы Wnt и Shh морфогена градиентов

Во раннего эмбрионального развития, клетки постепенно стремится следовать конкретные клоны дифференциации: это означает группу Тотипотентных (или плюрипотентных клеток) становятся постепенно ограничивается установления популяции клеток-предшественников определенных для возникновения одного типа клеток. Сигнализация межклеточных занимает центральное место в регуляции спецификации клонов во время эмбрионального развития. Манипулирование этих сигналов будет необходимо направить стволовые клетки к тем или иным судьбы поддерживать новые лечебные процедуры.

Относительно небольшое количество сигнальных путей повторяются в процессе развития, в том числе путей, отвечающих на надсемейства TGF (nodals и БМП) ^1-2, FGFs ³ Wnts ^{4 и 5} Ежики. Эти секретируемые белки связываются рецепторы, присутствующие на клеточной мембране, чтобы активировать передачу сигнала таким образом изменяя экспрессию генов и / или поведение клеток. Тесная регулирование клеточной знакAlling имеет важное значение для спецификации клеточных клонов и нормального развития. В то время как перекрестные помехи между этими путей имеет важное значение при определении судьбы клеток, один лиганд может сам вызывать различные реакции при различных концентрациях. Морфогена градиенты были описаны более 100 лет назад в качестве теории, чтобы объяснить, как различные типы клеток можно получить из поля ^ячеек 6. Сигнальные молекулы, производимые одной группы клеток могут диффундировать в течение определенного диапазона, уменьшая концентрации с большего расстояния от источника. Клетки подвергаются сигнала будет реагировать на локальной концентрации в их положении в области клеток, с клетками в различных позициях в ответ другому к различным уровням сигнала. Доказательства существования морфогенов из исследований раннего эмбриона дрозофилы ^{7 и 8} диска крыла, а также позвоночных конечности ^{9 и} нервной трубки ^10.

Методы необходимы вvestigate как морфогеном градиенты устанавливаются и определить другие молекулы, важные для регулирования этих градиентов. Элегантные эксперименты с использованием иммуногистохимии для визуализации эндогенных белков в естественных условиях в контексте различных генетических фоны были использованы для расследования морфогена градиенты ^11-12. Тем не менее, хорошие антитела и специфические мутанты не всегда доступны, поэтому мы здесь описывать протокол, используя избыточную экспрессию люминесцентных лигандов в Xenopus, чтобы обеспечить альтернативу, простой метод препарировать, как экзогенные генных продуктов может влиять на распределение лигандов по полю клеток. Xenopus Laevis обеспечивает отличную систему для выполнения этих типов экспериментов, их эмбрионы развиваются внешне так что они доступны на самых ранних стадиях. Их большой размер (1-1.5мм в диаметре) упрощает микроинъекции и хирургических манипуляций и бластула стадии клетки легко изображения, как они все еще относительно большой (около 2081; м в поперечнике). Избыточной экспрессии исследования в Xenopus являются просто сделать: мРНК вводят в начале эмбриона могут быть направлены на конкретных клеток и эффективно перевести.

Флуоресцентно меченые Wnt8a / Wnt11b-ГА-EGFP конструкций были получены с использованием PCS2 Wnt8a-HA ^13, PCS2 Wnt11b-HA ^{14 и} EGFP. НА, пептид важно включить не только для обеспечения дополнительного молекулярного тег, но и потому, что, как полагают, действуют как распорки, разделяющей белки Wnt и EGFP позволяет как генные продукты функционировать. Конструкция используется для визуализации Shh ранее был использован для генерации трансгенных мышей, экспрессирующих Тс-EGFP гибридный белок ^15; это было любезно предоставлено Энди Мак-Магон. Важно отметить, что метка GFP для всех конструкций, клонируют 3 'сигнальной последовательности таким образом, что сохраняется после обработки. Важно также, чтобы гарантировать, что окончательный белок включает в себя последовательности, необходимые для модификации, такие в сложения ип липидов, как и в случае Shh и Wnt ligands.The кДНК субклонировали в PCS2 + вектор экспрессии, который оптимизирован для снятые с производства синтетического мРНК; она включает в себя промотор SP6 и сигнал полиаденилирования (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

Работа описано здесь обеспечивает простой протокол для сравнения секрецию и распространение флуоресцентно помечены Wnt и Тс помечены лигандов. Вводя определенные суммы синтетического мРНК, протокол circumnavigates любые проблемы, связанные с переменным выражения из разных векторов, использующих различные промоторы. Эти методы были недавно применены для исследования последствий гепарансульфат endosulfatase Sulf1 на Тсс-EGFP и Wnt8a / секреции Wnt11b-ГА-EGFP и диффузии в Xenopus ^16-17.