Utilizando Análise de confocal<em> Xenopus laevis</em> Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

Durante o desenvolvimento embrionário inicial, as células são progressivamente comprometida a seguir linhagens específicas de diferenciação: isto significa um grupo de totipotente (ou pluripotentes) as células tornam-se progressivamente limitado ao estabelecimento de populações de células progenitoras determinados para dar origem a um tipo de célula. Sinalização célula-célula é central para a regulação da especificação das linhagens durante o desenvolvimento embrionário. A manipulação destes sinais serão necessários para dirigir células estaminais em relação a determinados destinos para suportar novos tratamentos médicos.

Um número relativamente pequeno de vias de sinalização são reiterados durante o desenvolvimento, incluindo as vias de resposta à superfamília TGF (nodals e BMPs) ^{1-2, 3} FGFs, Wnts ^{4, 5} e ouriços. Estas proteínas segregadas se ligam a receptores presentes na membrana celular para activar a transdução de sinal alterando desse modo a expressão do gene e / ou o comportamento das células. A regulação apertada de sinal de celularAlling é essencial para a especificação das linhagens de células e desenvolvimento normais. Enquanto a conversa cruzada entre estas vias é importante na determinação do destino celular, um único ligante pode-se desencadear respostas diferentes em diferentes concentrações. Gradientes de morfogénios foram descritos mais de 100 anos atrás, como uma teoria para explicar como os diferentes tipos de células pode derivar de um campo de células ^6. Sinalização moléculas produzidas por um grupo de células pode difundir-se ao longo de um determinado intervalo, diminuição da concentração com uma maior distância a partir da origem. As células expostas ao sinal irá responder à concentração local na sua posição no campo de células, com as células nas posições distintas de responder de forma diferente a diferentes níveis do sinal. A evidência para a existência de morfogénios vem de estudos de Drosophila embrião precoce ⁷ e o disco de asa ^8, bem como o membro de um vertebrado ⁹ e ¹⁰ do tubo neural.

Métodos são necessários noterrogam como gradientes morfogénio são estabelecidos e para identificar outras moléculas importantes na regulação desses gradientes. Experimentos elegantes usando imuno-histoquímica para visualizar as proteínas endógenas in vivo no contexto de diferentes origens genéticas têm sido utilizados para investigar gradientes de morfogénio ^11-12. No entanto, bons anticorpos e mutantes específicos nem sempre estão disponíveis, assim que nós descrevemos aqui um protocolo com a sobre-expressão de ligantes fluorescentes em Xenopus, para fornecer uma alternativa, método simples para dissecar como produtos de genes exógenos podem influenciar a distribuição de ligantes através de um campo de células. Xenopus laevis fornece um excelente sistema para realizar estes tipos de experimentos como os seus embriões se desenvolvem externamente para que eles sejam acessíveis nas fases iniciais. O seu grande tamanho (1-1.5mm de diâmetro) simplifica a microinjeção e manipulação cirúrgica e por blastula encena as células são fáceis de imagem como eles ainda são relativamente grande (cerca de 2081; m de diâmetro). Estudos sobre-expressão em Xenopus são simples de fazer: mRNA injetadas no embrião podem ser direcionados para determinadas células e eficiente é traduzido.

As construções Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescente marcados foram gerados usando pCS2 Wnt8a-HA ^13, pCS2 Wnt11b-HA ^{14 e} eGFP. O péptido HA é importante incluir, não só para proporcionar uma marca molecular adicional, mas também porque é pensado para agir como um espaçador que separa as proteínas Wnt e eGFP permitindo que ambos os produtos dos genes para funcionar. A construção utilizada para a visualização de Shh foi anteriormente usado para gerar um ratinho transgénico que expressa uma proteína de fusão de Shh-eGFP ^15; este foi gentilmente cedido por Andy McMahon. Importante, a etiqueta de GFP para todas as construções é clonada a 3 'da sequência de sinal de tal modo que é mantida após o processamento. Também é essencial para assegurar que a proteína final inclui sequências necessárias para tais modificações, o addition de lipídios como é o caso de Shh e Wnt ligands.The cDNAs foram subclonados no vector pCS2 + expressão que é otimizada para a Produção de mRNA sintético; que inclui um promotor de SP6 e sinal de poliadenilação (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

O trabalho descrito aqui fornece um protocolo simples para comparar a secreção e difusão de fluorescente etiquetado Wnt e Shh marcado ligantes. Ao injectar quantidades definidas de ARNm sintético, o protocolo circumnavigates quaisquer problemas associados com a expressão variável de diferentes vectores, utilizando diferentes promotores. Estes métodos foram recentemente aplicado para investigar os efeitos do sulfato de heparano Sulf1 endosulfatase em Shh-eGFP e Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP e secreção de difusão em Xenopus ^16-17.