Utilisation de l'analyse confocale<em> Xenopus laevis</em> Chargé d'enquêter sur les modulateurs de Wnt et Shh morphogène Dégradés

Au cours du développement embryonnaire précoce, les cellules sont progressivement engagés à suivre lignées spécifiques de différenciation: cela signifie un groupe de totipotentes (ou pluripotentes) cellules deviennent progressivement limité à établir des populations de cellules progénitrices déterminées pour donner naissance à un type de cellule. Signalisation cellule-cellule est au cœur de la régulation de la spécification de la lignée cours du développement embryonnaire. La manipulation de ces signaux sera nécessaire pour diriger les cellules souches vers destins particuliers pour soutenir nouveaux traitements médicaux.

Un nombre relativement faible de voies de signalisation sont réitéré au cours du développement, y compris les voies répondant à la superfamille TGF (nodals et BMP) ^1-2, FGF ^3, Wnts ^{4, 5} et hérissons. Ces protéines sécrétées lient des récepteurs présents sur la membrane de la cellule pour activer la transduction du signal en modifiant ainsi l'expression du gène et / ou le comportement des cellules. La réglementation stricte du signe de la celluleAlling est essentiel pour la spécification de la lignée cellulaire et le développement normal. Alors que la diaphonie entre ces voies est importante pour déterminer le destin des cellules, un seul ligand peut se solliciter des réponses distinctes à différentes concentrations. Gradients de morphogènes ont été décrits il ya plus de 100 ans comme une théorie pour expliquer comment les différents types de cellules peuvent dériver d'un domaine de ⁶ cellules. Signalisation des molécules produites par un groupe de cellules peut se diffuser sur une certaine plage, la diminution de la concentration avec une plus grande distance de la source. Les cellules exposées au signal répondront à la concentration locale à leur position dans le domaine des cellules, avec des cellules à des positions distinctes répondant différemment à différents niveaux du signal. Preuve de l'existence de morphogènes proviennent d'études sur l'embryon précoce Drosophila ⁷ et le disque de l'aile ^8, ainsi que la branche des vertébrés ^{9 et 10} tube neural.

Les méthodes sont nécessaires pour envestigate comment gradients morphogène sont établis et d'identifier d'autres molécules importantes dans la régulation de ces gradients. Élégantes immunohistochimie en utilisant des expériences de visualiser in vivo des protéines endogènes dans le contexte de différents contextes génétiques ont été utilisées pour étudier les gradients de morphogènes ^11-12. Toutefois, les bons anticorps et des mutants spécifiques ne sont pas toujours disponibles, de sorte que nous décrivons ici un protocole utilisant la surexpression de ligands fluorescents dans Xenopus, de fournir une alternative, méthode simple pour disséquer la façon dont les produits de gènes exogènes peuvent influencer la distribution de ligands à travers un champ de cellules. Xenopus laevis fournit un excellent système pour entreprendre ces types d'expériences que leurs embryons se développent à l'extérieur afin qu'ils soient accessibles dès les premiers stades. Leur grande taille (1-1.5mm de diamètre) simplifie la micro-injection et la manipulation chirurgicale et par étapes, la blastula cellules sont faciles à l'image car ils sont encore relativement grande (environ 2081; m de diamètre). Études de surexpression dans Xenopus sont simples à faire: ARNm injectés dans l'embryon précoce peuvent être ciblés vers des cellules particulières et est efficacement traduits.

Les constructions Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescence marqués ont été générés en utilisant pCS2 Wnt8a-HA ^13, pCS2 Wnt11b-HA ^{14 et} eGFP. Le peptide HA est important de comprendre, non seulement pour fournir une étiquette supplémentaire moléculaire, mais aussi parce que l'on pense à agir comme une entretoise qui sépare les protéines Wnt et eGFP permettant à la fois des produits de gènes de fonctionner. Le produit d'assemblage utilisé pour la visualisation de Shh a été précédemment utilisée pour générer une souris transgénique exprimant une protéine de fusion eGFP ^Shh-15; cela a été aimablement fourni par Andy McMahon. Fait important, l'étiquette de GFP pour toutes les constructions est clonée en 3 'de la séquence de signal de telle sorte qu'il est retenu après le traitement. Il est également essentiel de veiller à ce que la protéine finale comprend des séquences nécessaires à la modification, par exemple supplén des lipides comme est le cas pour Shh et Wnt ligands ADNc ont été sous-cloné dans le vecteur d'expression pCS2 + qui est optimisé pour la prodution de l'ARNm synthétique; il comprend un promoteur SP6 et le signal de polyadénylation (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

Le travail décrit ici fournit un protocole simple pour comparer la sécrétion et la diffusion de fluorescence étiqueté Wnt et Shh marqués ligands. En injectant des quantités définies de l'ARNm synthétique, le protocole fait le tour des problèmes associés à l'expression variable à partir de différents vecteurs utilisant différents promoteurs. Ces méthodes ont été récemment appliqué pour étudier les effets du sulfate d'héparane endosulfatase Sulf1 sur Shh-eGFP et Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP la sécrétion et la diffusion chez Xenopus ^16-17.