Met behulp van confocale Analyse<em> Xenopus laevis</em> Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek
Summary
Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.
Abstract
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor liganden verdeeld over een gebied van cellen zichtbaar. Het gemak van exogene eiwitten tot expressie brengen, samen met de grote omvang van de cellen in vroege embryo, maak Xenopus laevis een bruikbaar model voor het visualiseren van GFP-gelabeld liganden. Synthetisch mRNA's efficiënt worden omgezet na injectie in vroeg stadium Xenopus embryo en injecties kunnen worden gericht op een cel. In combinatie met een afstamming tracer bijvoorbeeld membraan gebonden RFP, kan de geïnjecteerde cellen (en het nageslacht) die produceren het eiwit tot overexpressie goed te volgen. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de bereiding van fluorescent gelabeld Shh en Wnt liganden van geïnjecteerde mRNA. De methoden omvatten het micro dissectie van ectodermale explantaten (dierlijke caps) en de analyse van de ligand diffusie in meerdere monsters. Via confocale beeldvorming kan informatie over ligand secretie en diffusie over een gebied van cellen verkregen. Statistische analyses van confocale beelden te leveren kwantitatieve gegevens over de vorm van ligand gradiënten. Deze werkwijzen kunnen nuttig voor onderzoekers die willen het effect van factoren die de vorm van morfogeen gradiënten kunnen reguleren testen.
Introduction
Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, worden de cellen progressief inzetten voor specifieke lijnen van differentiatie te volgen: dit betekent een groep totipotent (of pluripotente cellen) worden geleidelijk beperkt tot de oprichting van populaties van voorlopercellen vastbesloten om tot één type cel geven. Cel-cel signalering staat centraal in de regulering van afstamming specificatie tijdens de embryonale ontwikkeling. Manipulatie van deze signalen zullen moeten richten stamcellen richting bepaald lot tot nieuwe medische behandelingen steunen.
Een relatief klein aantal signaalwegen worden herhaald tijdens de ontwikkeling en trajecten reageren op de TGF superfamilie (nodals en BMPs) 1-2, FGF 3, Wnts 4 en 5 egels. Deze uitgescheiden eiwitten binden receptoren aanwezig op het celmembraan signaaltransductie waardoor genexpressie en / of celgedrag wijzigen activeren. De strakke regulering van cel tekenAlling is essentieel voor cellijn specificatie en normale ontwikkeling. Terwijl de overspraak tussen deze trajecten is belangrijk bij het bepalen lot van de cel kan één ligand zelf opwekken afzonderlijke responsen bij verschillende concentraties. Morfogen gradiënten werden meer dan 100 jaar geleden beschreven als een theorie uit te leggen hoe de verschillende celtypes kan voortvloeien uit een gebied van 6 cellen. Signalering moleculen geproduceerd door een groep cellen kan diffunderen over een bepaald bereik, afnemende concentratie met een grotere afstand tot de bron. Cellen blootgesteld aan het signaal reageert op de lokale concentratie hun positie op het gebied van de cellen met cellen op verschillende plaatsen verschillend reageren op verschillende niveaus van het signaal. Bewijs voor het bestaan van morfogenen komt uit studies van de vroege Drosophila embryo 7 en de vleugel schijf 8, alsmede de vertebraat ledemaat 9 en 10 neurale buis.
Methoden nodig om inMaastricht onderzoek hoe morfogen hellingen worden vastgesteld en aan andere moleculen belangrijk in het reguleren van deze gradiënten identificeren. Elegante experimenten met immunohistochemie endogene eiwitten te visualiseren in vivo in de context van verschillende genetische achtergronden werden gebruikt om morfogeen gradiënten 11-12 onderzoeken. Echter, goede antilichamen en specifieke mutanten zijn niet altijd beschikbaar, dus we beschrijven hier een protocol via overexpressie van fluorescente liganden in Xenopus, een alternatieve, eenvoudige methode te ontleden hoe exogene genproducten over een gebied van cellen verdeling van liganden beïnvloeden verschaffen. Xenopus laevis biedt een uitstekend systeem om dit soort experimenten te ondernemen als hun embryo's te ontwikkelen extern, zodat ze toegankelijk zijn in de vroegste stadia. Hun grote omvang (1-1.5mm diameter) vereenvoudigt micro-injectie en chirurgische manipulatie en door blastula stadia van de cellen zijn gemakkelijk te afbeelding als ze zijn nog steeds relatief groot (ongeveer 2081; m doorsnee). Overexpressie studies in Xenopus zijn eenvoudig te doen: mRNA geïnjecteerd in het vroege embryo kan worden gericht op specifieke cellen en efficiënt vertaald.
De fluorescent gelabeld Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP-constructen werden gegenereerd met behulp pCS2 Wnt8a HA-13, pCS2 Wnt11b HA-14 en eGFP. De HA peptide van belang op te nemen, niet alleen een extra moleculaire merker te verschaffen, maar ook omdat men denkt dat fungeren als afstandhouder scheiden van de Wnt en eGFP eiwitten waardoor beide genproducten functioneren. Het construct gebruikt voor het visualiseren van Shh is eerder gebruikt om expressie van een transgene muis een Shh-eGFP fusieproteïne 15 genereren; Dit werd vriendelijk verschaft door Andy McMahon. Belangrijk is dat de GFP-tag van alle constructen gekloneerd 3 om de signaalsequentie zodat wordt behouden na verwerking. Het is ook essentieel dat de uiteindelijke eiwit bevat sequenties die vereist zijn voor modificaties, zoals de addition lipiden zoals het geval is voor Shh en Wnt ligands.The cDNAs werden gesubkloneerd in de pCS2 + expressievector die is geoptimaliseerd voor het prodution synthetische mRNA; deze een SP6 promoter en polyadenylatiesignaal (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
De hier beschreven werk biedt een eenvoudig protocol voor het vergelijken van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabeld Wnt en Shh gelabeld liganden. Door het injecteren van gedefinieerde hoeveelheden synthetische mRNA, het protocol circumnavigates problemen geassocieerd met variabele expressie van verschillende vectoren met verschillende promotors. Deze werkwijzen zijn onlangs toegepast om de effecten van de heparan sulfaat endosulfatase Sulf1 op Shh-eGFP en Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP secretie en diffusie in Xenopus 16-17 onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een essentieel onderdeel van dit protocol is het genereren van biologisch actieve liganden die normaal worden verwerkt, afgescheiden, en in staat om een reactie in de ontvangende cel te lokken, ondanks het feit dat een fluorescerende groep gehecht. Het is cruciaal om te tonen dat de fluorescent gelabelde genproduct biologisch actief met een geschikt assay. Voor Shh-GFP, het vermogen om de expressie van PTC1 activeren bevestigd 16. Wnt8a heeft een opmerkelijk krachtige vermogen om een nevenas in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een BBSRC verlenen aan MEP (BB / H010297 / 1), een BBSRC quotum studententijd aan SAR en een MRC studententijd naar SWF.
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
References
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).
