باستخدام تحليل متحد البؤر من<em> القيطم المورق</em> بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات
Summary
مخطوطة يوفر هنا مجموعة بسيطة من طرق لتحليل إفراز ونشر بروابط الموسومة fluorescently في القيطم. ويوفر هذا السياق لاختبار قدرة بروتينات أخرى لتعديل توزيع يجند والسماح التجارب التي قد تعطي نظرة ثاقبة آليات تنظيم التدرجات محدثة التخلق.
Abstract
يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصور بروابط توزيعها عبر حقل من الخلايا. سهولة التعبير عن البروتينات الخارجية، جنبا إلى جنب مع حجم كبير من الخلايا في الأجنة في وقت مبكر، وجعل القيطم المورق نموذجا مفيدا لتصور بروابط الموسومة GFP. يتم ترجمتها من mRNAs الاصطناعية بكفاءة بعد الحقن في مرحلة مبكرة أجنة القيطم، والحقن يمكن أن تستهدف خلية واحدة. عندما جنبا إلى جنب مع التتبع النسب مثل غشاء المربوطة طلب تقديم العروض، وحقن الخلايا (ونسله) التي تنتج البروتين overexpressed يمكن بسهولة أن يتبع. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإنتاج الموسومة من fluorescently WNT وShh على بروابط من حقن مرنا. أساليب تنطوي على ميلCRO تشريح إإكسبلنتس الأدمة (القبعات الحيوان) وتحليل يجند نشر في عينات متعددة. باستخدام التصوير متحد البؤر، معلومات عن إفراز يجند ونشر أكثر من مجال الخلايا يمكن الحصول عليها. التحليلات الإحصائية للصور مبائر توفر البيانات الكمية على شكل تدرجات يجند. قد تكون هذه الطرق مفيدة للباحثين الذين يرغبون في اختبار آثار العوامل التي يمكن أن تنظم شكل تدرجات محدثة التخلق.
Introduction
أثناء التطور الجنيني المبكر، والخلايا التي ارتكبت تدريجيا لمتابعة الأنساب محددة من التمايز: وهذا يعني مجموعة من مكتملة النمو (أو المحفزة) الخلايا تصبح مقيدة تدريجيا إلى إقامة السكان من الخلايا الاصلية العزم على أن تؤدي إلى نوع خلية واحدة. إشارات الخلية خلية مركزية لتنظيم مواصفات النسب أثناء التطور الجنيني. سوف تكون هناك حاجة التلاعب في هذه الإشارات لتوجيه الخلايا الجذعية نحو مصائر خاصة لدعم العلاجات الطبية الجديدة.
وأكد عدد صغير نسبيا من مسارات الإشارات خلال التنمية، بما في ذلك مسارات الاستجابة إلى الفصيلة TGF (nodals وأفضل الممارسات الإدارية) 1-2، عوامل النمو FGFs 3، 4 Wnts، والقنافذ 5. هذه البروتينات يفرز ربط مستقبلات موجودة على غشاء الخلية لتنشيط نقل الإشارة وبالتالي تغيير التعبير الجيني و / أو سلوك الخلية. تنظيم محكم من علامة الخليةalling أمر ضروري للمواصفات سلالة الخلايا والتطور الطبيعي. في حين أن الحديث المتبادل بين هذه الممرات مهم في تحديد مصير الخليوي، ويجند نفسه واحد يمكن أن تثير ردود متميزة في تركيزات مختلفة. وقد وصفت التدرجات محدثة التخلق منذ أكثر من 100 سنة بوصفها نظرية لشرح كيفية مختلف أنواع الخلايا يمكن أن تجنيها من حقل الخلايا 6. تشوير الجزيئات التي تنتجها مجموعة واحدة من الخلايا قد نشر على نطاق معين، وخفض التركيز في مسافة أكبر من المصدر. والخلايا المعرضة للإشارة لرد على تركيز المحلية في مركزها في مجال الخلايا، والخلايا في مواقع متميزة تستجيب بشكل مختلف لمستويات مختلفة من الإشارات. الدليل على وجود morphogens يأتي من الدراسات في وقت مبكر من ذبابة الفاكهة الجنين 7 و القرص الجناح 8، وكذلك الأطراف الفقارية 9 و 10 الأنبوب العصبي.
وهناك حاجة إلى أساليب لفيvestigate كيف التدرجات محدثة التخلق يتم وضع وتحديد جزيئات أخرى مهمة في تنظيم هذه التدرجات. وقد استخدمت التجارب أنيقة باستخدام المناعية لتصور البروتينات الذاتية في الجسم الحي في سياق خلفيات وراثية مختلفة لتحقيق التدرجات محدثة التخلق 11-12. ومع ذلك، والأجسام المضادة جيدة والمسوخ محددة ليست متوفرة دائما، لذلك نحن هنا وصف البروتوكول باستخدام overexpression من بروابط الفلورسنت في القيطم، لتوفير بديل، طريقة بسيطة لتشريح كيفية منتجات الجين الخارجية يمكن أن تؤثر في توزيع بروابط عبر حقل من الخلايا. يوفر القيطم المورق نظام ممتاز لإجراء هذا النوع من التجارب مع تطور الأجنة من الخارج بحيث يمكن الوصول إليها في المراحل الأولى. حجمها كبير (1-1.5mm في القطر) يبسط microinjection والتلاعب الجراحية ومراحل الأريمة الخلايا هي سهلة لصورة لأنها لا تزال كبيرة نسبيا (حوالي 2081؛ م عبر). دراسات Overexpression في القيطم هي بسيطة للقيام: مرنا حقنها في الجنين في وقت مبكر يمكن أن تستهدف خلايا معينة، ويتم ترجمتها بكفاءة.
تم إنشاء الموسومة fluorescently بنيات Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP باستخدام pCS2 Wnt8a-HA 13، pCS2 Wnt11b-HA 14 و EGFP. الببتيد HA مهم لتشمل، ليس فقط لتوفير علامة الجزيئية إضافية، ولكن أيضا لأنه يعتقد أن تتصرف كفاصل فصل البروتينات WNT وEGFP يسمح كل من المنتجات الجينات لتعمل. التركيبة المستخدمة لتصور Shh على استخدمت في السابق لتوليد الماوس المعدلة وراثيا تعبر عن Shh على-EGFP الانصهار البروتين 15؛ هذا وقدمت تفضلت اندي مكماهون. الأهم من ذلك، هو استنساخ العلامة GFP لجميع بنيات 3 'إلى تسلسل إشارة بحيث يتم الاحتفاظ بها بعد المعالجة. ومن الضروري أيضا لضمان أن البروتين النهائي يتضمن تسلسل المطلوبة للتعديلات، مثل وadditioن من الدهون كما هو الحال بالنسبة لShh على وWNT ligands.The cDNAs تم subcloned في pCS2 + ناقلات التعبير الذي هو الأمثل لبرودوشن مرنا الاصطناعية. ويشمل المروج SP6 وإشارة تذييل بعديد الأدينيلات (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
العمل الموصوف هنا يوفر بروتوكول بسيط للمقارنة بين إفراز ونشر الموسومة fluorescently WNT وShh على الموسومة بروابط. عن طريق حقن كميات محددة من مرنا الاصطناعية، وبروتوكول circumnavigates أي مشاكل المرتبطة التعبير متغير من نواقل مختلفة استخدام منشطات مختلفة. وقد تم مؤخرا تطبيق هذه الأساليب لتحقيق في الآثار المترتبة على سلفات endosulfatase heparan Sulf1 على Shh على-EGFP وWnt8a / إفراز Wnt11b-HA-EGFP ونشرها في القيطم 16-17.
Protocol
Representative Results
Discussion
جزء أساسي من هذا البروتوكول هو توليد بروابط نشطة بيولوجيا والتي تتم معالجتها عادة، يفرز، وقادرة على استثارة رد فعل في الخلية المستقبلة، على الرغم من وجود شاردة الفلورسنت المرفقة. فمن الأهمية بمكان لإثبات أن المنتج الجينات fluorescently الموسومة نشطة بيولوجيا باستخدام ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل من قبل BBSRC هذا العمل منحة الهندسة الكهربائية والميكانيكية (BB / H010297 / 1)، حصة studentship BBSRC ريال، وstudentship MRC إلى SWF.
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
References
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).
