Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
Forstå mekanismene som membran proteiner oppfyller deres cellular funksjon kan ofte være en utfordrende oppgave, fordi deres virkningsmekanismer er ofte definert av lave affinitetsinteraksjoner, som er vanskelig å oppdage og evaluere ved vanlige biokjemiske metoder. Membranproteinene kan dessuten være sterkt anriket på spesifikke membrandomener 5,6- eller danner dynamiske høyere ordens strukturer, som i prinsippet kan endre deres biologiske aktivitet 7.
Non-invasiv laser-assistert enkelt molekyl fluorescens mikroskopi har dermed blitt metodikken av valget for å studere protein atferd i komplekse cellulære miljøer. Dette er spesielt sant for biokjemiske prosesser som finner sted på plasmamembranen, ettersom disse kan i prinsippet bli overvåket i støyredusert Total Internal Reflection (TIRF) modus. Her prøven belysning er begrenset til en opp til 200 nm-tynn skive i umiddelbar nærhet til et glass surface, noe som resulterer i et betydelig tap i cellulær bakgrunn og, på grunn av egenskapene til det flyktige eksitasjonslyset, også i en betydelig økning i fluorescens signalintensitet 8,9. Begge deler er viktig når sikter for høyt posisjon og tidsmessig oppløsning i enkelt deteksjon molekyl.
Planar SLBs er ikke bare kompatibel med TIRF mikroskopi. Når funksjonalisert med egnede ligander de gir også direkte tilgang til å studere de molekylære dynamikken i celle-celle-gjenkjennelse som de forekommer i immunceller eller andre celler. De kan også bare benyttes til å posisjonere motile og ellers ikke-adherente celler nær nok til objektglasset, slik at slike celler kan avbildes i TIRF belysning, noe som er meget ønskelig når lednings forsøk med enkelt molekyl sporing eller enkelt molekyl-baserte superresolution. For dette formål proteiner må lastes på en svært mobile SLB. En iboende fordel av brukt li PIDs er at det ikke er uspesifikk binding av proteiner som i det hele tatt. Videre kan SLBs betraktes som to-dimensjonale væsker med en iboende evne til å helbrede seg selv; uregelmessigheter i glasset støtte kompenseres opp til en viss grad. En trinnvis protokollen er gitt for å generere svært mobile bilag belastet med proteiner av interesse. Dannelsen av plane SLBs er beskrevet, som inneholder 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (POPC) som hovedbestanddelen (90-99%), og de syntetiske og funksjonaliserte lipid 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3 – {[N (5-amino-1-karboksypentyl) iminodieddiksyre] succinyl} nikkelsalt (DGS NTA-Ni) i lav mengde (1-10%). POPC bærer en mettet fettsyre og en mono-umettet fettsyre og danner lipidbilag med høy flyteevne selv ved RT. DGS NTA-Ni binder seg med sin hodegruppe til poly-histidin haler og fungerer som anker for poly-histidin-merket proteiner av valg (figur 1).
"> Viktigere, må den mikros maskinvare inkluderer en rekke eksterne enheter som er beskrevet nedenfor. Med informasjonen og noen grunnleggende kunnskap i optikk og laserfysikk, bør enhver biolog kunne bygge et enkelt molekyl bildebehandling oppsett. Sample eksitasjon bør ideelt sett være utføres på et invertert mikroskop i Total Internal Reflection (TIRF) -modus som denne kuren reduseres falsk lys og sterk bakgrunn resulterer på annen måte mot cellulær auto-fluorescens 9. For dette, en spesiell TIRF-stand objektiv (se nedenfor) og laser belysning er nødvendig. Noen eksperimenter vil kreve belysnings ganger i løpet av millisekund rekkevidde og drives i rask rekkefølge. For å spare belysningstiden eller for å unngå unødvendig blekingen på grunn av repeterende belysning er det ofte nyttig å splitte det utsendte lys i to eller flere spektralkanaler. Dette gjør det mulig for samtidig utlesing av to eller flere utslippsprofiler, som kan bli en betydelig faktor når conducelle eksperimenter som involverer Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Her utslipp som følge av enkelt eksitasjonslys puls kan tas opp både fra FRET donor og FRET akseptor (som sensitivisert utslipp). Kameraet skal fange nok fotoner med tilstrekkelig lav bakgrunnen for å visualisere enkelt fluorophores under belysning tid. Dataprogram må være opp til oppgaven å synkron eksitasjon stenge og image oppkjøpet. En omfattende oversikt er gitt nedenfor og i figur 2:TIRF-stand mål: For målbasert TIRF belysning numerisk apertur (NA) på objektivet må være lik eller større enn 1,4 ved hjelp av standard glass (n = 1,515) 9. Forstørrelse kan variere mellom 60x til 150x. Målet bør kromatisk korrigert for å tillate confocality når avbildning forskjellige fluorophores.
Lasere: Antallet tilgjengelige laser alternativer har økt betydelig de siste årene. Moderne elektronisk moduler kontinuerlig bølge diode lasere er kostnadseffektive og kan betjenes med enestående frekvens og hastighet. Dyrere gass ion lasere utmerke seg i laserstrålen kvalitet, men krever ekstern stenge (se nedenfor) og ofte omfattende (vann-) kjøling.
Eksitasjon skodder: Acousto-optiske modulatorer (AOM) tillater rask stenge i rask rekkefølge 10. For stramt stenge kombinasjonen av en AOM med mekaniske skodder anbefales. Denne måten omfattende oppvarming av AOM på grunn av eksponering kontinuerlig lys unngås og lys lekker fra AOM i av-stillingen er kansellert ut.
Linser brukes til å utvide laserstråler, og å fokusere dem inn på baksiden fokalplanet til objektivet. På denne måten lar det eksitasjonslys objektivet som en parallellstråle (figur 3), som er nødvendig for belysning av TIRFprøven. Flytting av navet i ryggen fokalplan fra sentrum til periferien av mål vil endre vinkelen på hvilken strålen forlater målet, men ikke plasseringen av laserpunktet på prøven (figur 3), som er en funksjon av den samlede stråle geometri. TIRF belysning oppstår i en kritisk vinkel, som kan justeres ved hjelp av et sett med speil fungerer som et periskop å oversette det sentrale punktet i laseren innenfor fokusplanet på objektivet. Linsene skal være kromatisk korrigert og kan anvendes i et sett av to eller tre linser. En tre-linsesystemet består av to linser som virker som et teleskop for å utvide laserstrålen (og dermed belysningen sted i prøven), og en tredje linse for å fokusere den utvidede strålen inn på baksiden fokalplan for objektiv (figur 4). Begge funksjonene (teleskop og fokus) kan også oppnås ved en kombinasjon av to objektiver bare (se figur 4).
<p class="jove_content"> Speil bør være minst 95% reflekterende for å unngå tap av laserlys. For hver bjelke justering et sett av to speil er vanligvis brukt som sådan anordning er tilstrekkelig til å nøyaktig justere en hvilken som helst vinkel og posisjon av en laserstråle.Dikroiske overlegg reflekterer og slippe gjennom lys med forskjellige bølgelengder som er spesifisert, og blir brukt til å overlagre eller dele bjelkene av to lasere.
Polychroic filtre er mer kompleks enn dikroiske filtre, og for å reflektere innkommende eksitatorisk lys og overfører lys som kommer ut emisjon fra prøven. De er plassert i filter kuben mellom objektiv og mikroskopet røret linsen.
Rydd opp filtre: Avhengig av hvilken type laser employe d laser rydde opp filtre med en smal overføring båndbredde bør plasseres inn i laserstrålen rett etter at den forlater laser.
Notch filtreer konstruert for effektivt å absorbere laserlyset med en smal båndbredde og overfører alle andre lys. De er plassert i emisjonsbanen for å filtrere ut uønsket laser eksitasjonslys. Men hakk filtre fungerer bare ved 0 ° innkommende vinkel. Hvis båndbredden av kamfilteret er meget skarp, kan de forskjellige innkommende vinkler ikke reflekteres noe mer. Blokkering av kollimert laser laserlys er ikke berørt, men tilbakespredte lyset kanskje ikke effektivt hindret fra å nå kameraet.
Motoriserte filter hjul utstyrt med passende filtre hjul lett kan plasseres i eksitasjon og emisjon sti og tillater enkel veksling mellom ulike lysintensiteter (når utstyrt med ND filter) eller fluoriserende kanaler (når den plasseres foran en xenon eller kvikksølv arc lampe for ratiometrisk kalsium avbildning eller foran kameraet til å velge for emitting fluorophore).
50:50 kube stråledeler cen benyttes for å splitte laserstrålene i to separate eksitasjon stråleveier, og også for å kombinere dem foran periskop.
Strålesplitter (emisjon bane): For rask bildeoverføring uten behov for fysiske filterskift, er utslipp strålen delt inn i en blå-skiftet og rød-skiftet kanal. I prinsippet kan stråledelere bygges ved å benytte en dikroisk kile eller et sett av speil og et dikroisk speil for å skille utslippsstråle i et bølgelengdeavhengig måte. To emisjonsfiltre for å rydde opp i de utsendte kanaler.
Romfilter: Romlig filtrering av magnetisering strålen er noen ganger nødvendig for å fjerne ikke-parallelle lysstråler som sendes ut fra lavkvalitets laserstråler. En romlig filter består av en to-linse teleskop med et lite hull plassert nøyaktig på det sentrale punktet i begge objektivene. På denne måten falsk lys som følge av ikke-parallelle partier av laserstrålen blir effektivt blokkeres. Such betingelser må være oppfylt ved etablering TIRF basert mikroskopi. Romlig filtrering øker med mindre hull, som er vanskeligere å plassere inn i navet, og med mindre brennvidder på den første linse. For å redusere effekter på grunn av objektiv avvik det er fordelaktig å benytte i stedet for enkle objektiver med høy kvalitet og uendelig-korrigert mikroskop mål med lav forstørrelse (10x eller 20x).
Periskop: Et periskop oppsett er nødvendig for å oversette den fokuserte laserstrålen innenfor den tilbake fokalplan for objektiv, en forutsetning for TIRF avbildning. Det kan lett bygges av to to-tommers speil, et translasjonelt scene for å justere den første speil, og en post for posisjonering av andre speil for å reflektere det utvidede og fokusert magnetisering stråle inn i mikroskopet (figur 5).
Kamera: Back-belyst Electron-multiplisere Charge Coupled Devices (EMCCD) blir rutinemessig brukt foropptak av enkelt molekyl signaler. Dette er på grunn av deres høye kvantumutbytte (opptil 95%), høy anskaffelses hastighet (opp til 30 MHz) og forholdsvis lite støy. Avkjøling til -80 ° C reduserer termisk støy, og er støttet av en rekke tilgjengelige EMCCD kameraer. En begrensning av den EMCCD teknologien er at kamerastøy øker lineært med både kamera og forsterkning til signalet som blir tatt. Dette er ikke tilfelle med vitenskapelige CMOS (sCMOS) kameraer, som er betydelig mindre kostbare og drive på grunn av den spesielle arkitekturen av sCMOS brikken også mye raskere enn EMCCD kameraer. Men et problem i forbindelse med CMOS-teknologi er at bildeinnsamling mangler fortsatt en viss grad av en kvantitativ avlesning på et enkelt molekyl nivå, fordi hver pixel har forskjellig følsomhet. I prinsippet kan dette kompenseres gjennom pixel normalisering, men denne fremgangsmåten er på ingen måte trivielle 11. Dette er grunnen til at vi fortsatt nøler med å reberømmer sCMOS kameraer for enkelt molekyl mikroskopi, men i lys av den raske utviklingen av denne teknologien, kan sCMOS kameraer snart bli kameraet av valget. Slow scan CCD-kameraer kameraer unngå forsterkning relatert støy og piksel varians alle sammen og støtte raskest oppkjøps priser hvis de kan brukes i en såkalt "kinetic" -modus. I denne modusen hele kamerabrikke med unntak av en region av interesse (ROI) er maskert, som gjør det mulig å benytte selve brikken som en lagringsenhet. Etter ROI er eksponert for første gang, blir de resulterende avgifter forskjøvet inn i det maskerte område på brikken piksel for piksel linje linje, der bildet er beskyttet fra videre eksponering lys. Når forskyvningen av alle linjer i ROI inn i det maskerte område er fullført (i sub-millisekund-området), er ROI seg klar for neste eksponering. Denne syklusen gjentas inntil samtlige bildeelement linjer av CCD-brikken belastes. Brikken leses deretter langsomt ut med markert reduced avlesning støy. For eksempel på en 1000 x 1300 pixel chip, kan 20 Rois av 50×50 pikslers tas opp i rask rekkefølge. Fordi bildene forblir på brikken for en betydelig tid før den blir lest ut, er det avgjørende for å sikre høy kvalitet på maskering og til å kjøle kamera (for eksempel med flytende nitrogen) som et middel for å redusere overdreven termisk støy. Noen EMCCD kameraer støtter også den kinetiske modus.
Programvare: Timing av lasere, skodder, AOMS og kameraeksponering samt riktig bildelagring er integrert i enhver vellykket bildebehandling eksperiment. I prinsippet mange definerte operasjoner kan programmeres med tilgjengelige programvarepakker som følger med kameraet. Kommersielle programvarepakker støtte et stort antall hardware enheter, som kan gjennomføres med litt teknisk kompetanse.
Pulsgenerator, Data Acquisition (DAQ) brett (med analoge og digitale utgangskanaler) og oscilloskop: En pulsgenerator er enutmerket valg for å konvertere triggerpulser inn pulser av definert tid og spenning. På denne måten lasere kan kontrolleres nøyaktig for utgangseffekt og tidsbestemt i millisekund for å undermillisekund rekkevidde. DAQ boards med analoge utganger oppnå det samme og er lett integreres i hovedkortet på datamaskinen via PCI-spor. Puls varighet, amplitude og frekvens er verifisert med et oscilloskop.
Inngjerding av hele eksitasjon strålebanen: For å unngå svingninger i eksitasjon profilen grunn til luft convections hele eksitasjon strålebanen bør inntas fra sin lab miljø. Dette tiltaket er spesielt viktig når du utfører TIRF mikroskopi. Optiske komponenter er også beskyttet mot støv og det menneskelige øye ved eksponering laserlys. Vedlegg kan være enkelt å bygge fra svart kort styret, som kan kjøpes i kunst forsyne butikkene.
For å bestemme flyten av SLB Fluorescens Recovery Etter PhotobleacHing (FRAP) målinger 12 er utført. For FRAP eksistensen av to eksitasjon stråleveier er tilrådelig (se figur 3). Den første strålebane er utformet for å avbilde fluorescens av bilaget. Dette kan gjøres i TIRF konfigurasjon og med lav lysintensitet. Den andre strålebane bør tillate en kort, men intens puls blekemiddel, og bør være konfigurert i ikke-TIRF modus, slik at den forlater målet langs den optiske aksen. En rund åpning kan plasseres inn i den eksitasjon strålegangen (se figur 8) for å projisere en perfekt runde blekemiddel profil med definerte kanter. For å avbilde denne åpning på objektplan, ville dens optimale stilling være i fokalplanet for linsen 3 (se figur 3). Men på grunn av den lange brennvidde av denne linse, en åpning bilde av tilstrekkelig kvalitet kan også genereres, når åpningen er plassert på litt forskjøvet posisjoner.
Etter å ha utført than bildebehandling eksperiment rådata må analyseres på riktig måte. Flere trinn-for-trinn-protokoller er tilbudt, som dekker justering av hovedinnstillingene (f.eks belysning strøm og tid, TIRF vinkel), anskaffe og analysere dataene.
Enkelt molekyl mikros gir en unik mulighet til å studere atferden til proteiner i sitt eget mobilmiljø. Molekylær avbildning blir derfor stadig mer attraktiv for en bred faglig samfunn, men mange livs forskerne fortsatt viker unna den opprinnelige investeringen i teknologi og kompetanse. Den største fordelen som oppstår ved montering av en egen bildedannende system, er at det lett kan justeres til noen spesifikke behov.
Som antydet heri et ikke-TIRF eksitasjon stråle kan lett implementeres i tillegg til en eksisterende TIRF lysbanen, hvis rask og definert foto-bleking (eller -activation) av fluoroforer og ligander er ønskelig, for eksempel når det utføres FRAP eller ligand uncaging eksperimenter 14 . Innføringen av en emisjonsstrålesplitteren gjør det mulig for samtidig opptak av minst to og i enkelte tilfeller opp til fire fluorescerende kanaler. Listen over utvidelser er i hovedsak kun begrenset avens egen fantasi.
For eksempel, implementere en motorisert utslipp filter hjul i utslippsbanen gir mulighet for rask veksling mellom opptil ti ulike fluorescerende kanaler. Når man kombinerer to motoriserte utslipp filter hjul (hver utstyrt med 10 filterslissene) i serien, opp til 18 fluorescerende kanaler kan leses ut. TIRF-baserte bilde kan kompletteres med kalsium mobiliserings målinger og Interference Reflection Mikros (IRM) etter integrering av en Xenon eller Mercury eksitasjon lampe banen. IRM er metoden for valg for å visualisere i hvilken grad cellene er festet til glassoverflaten eller en SLB og kan dermed tilveiebringe kritisk informasjon når man tolker TIRF basert bildedata. Etablering av en utvidet eksitering stråle ved bruk av et dikroisk speil enkel og ytterligere laser på 405 nm gjør det mulig å gjennomføre fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM), dvs. to superresolution metoder med en posisjonsnøyaktighet under diffraksjonsgrensen av synlig lys 15,16.
Det er imidlertid eksperimentelt suksess ikke bare et spørsmål om passende maskinvare. For å dra full nytte av støyredusert TIRF-baserte bildediagnostikk, bør cellene ta kontakt til en overflate på en måte som ikke setter begrensninger på celleoverflaten eller som forstyrrer fysiologi av sine plasmamembran. SLBs funksjonalisert med egnede proteiner for celleadhesjon har overstiger godt egnet for dette formål, fordi alle SLB-innvevde ligander er sideveis mobile og justere deres sideveis stilling i bilaget i respons til reseptorbinding og segregering dynamikk.
Å produsere SLBs i en reproduserbar måte, er det best å starte med SUV med høy renhet. Som beskrevet heri, er det derfor viktig å fjerne multilamellære vesikler, som også dannes ved ultralydbehandling, i to ultra-sentrifugeringstrinn som i dissenterfere med dannelse av sammenhengende SLBs med høy flyt. SLBs av høy kvalitet skjemaet bare på rene glassflater. Når renset glass bør brukes umiddelbart eller oppbevares i vakuum. Viktigere, SLBs må aldri utsettes for luft, da dette ville føre til deres avbrudd. SLB vasking omfatter, som vist, buffer skylling med bruk av en serologisk pipette, da dette ikke bare er en, men sparer også tidsbesparende fremgangsmåte.
Under høsting og rensing av SLB-resident proteiner ved bruk av vaskemidler bør unngås. Dette er fordi vaskemiddel vil redusere protein mobilitet betraktelig, selv når de er tilstede i spormengder. For å omgå behovet for vaskemiddel sammen, er oppløselig ekspresjon av utskilt polyhistidin tag utstyrt ligander anbefalt i pattedyr eller insektceller. Hvis refoldingen fra E.coli inkludering organer er nødvendig, må forsiktighet brukes til å fjerne vaskemidler effektivt fra inklusjonslegemer før de un- og refoldingen.
En stor fordel med å anvende SLBs resultater fra deres modulære og reconstitutive natur, noe som gjør det mulig å spesifikt dissekere rollen av en gitt reseptor-ligand interaksjonen for celleaktivering og celleadhesjon. I denne forbindelse er det viktig å nevne at DGS NTA-Ni bør være tilstede på 10% innen de SLB for å hindre at proteiner som konkurrerer om NTA-NI bindingssteder. Ved ansettelse SLBs huser kun 1% eller 2% DGS NTA-Ni, en reduksjon i foreningen av en gitt polyhistidin-merket protein arter kan bli lagt merke til, spesielt når co-inkubasjon økende mengder av et sekund polyhistidin-tagget protein arter (upublisert observasjon). Dette fenomenet er ikke observert under arbeid med SLBs med 10% DGS NTA-Ni.
Selv om vi ikke har observert ikke-spesifikk binding av enhver polyhistidin-merket protein testet for å SLBs inneholder DGS NTA-Ni, bør denne muligheten testes ved å innføre et protein som for første gang,For å oppnå dette anbefaler vi bruk av SLBs blottet for DGS NTA-Ni (proteinet bør ikke binde). For det andre, når du bruker en SLB inneholder DGS NTA-Ni, bør protein komme seg helt etter vask SLB med PBS som inneholder 300 mm -imidazol.
En annen viktig fordel med å ansette SLBs er at forbigående samhandling og signal hendelser kan overvåkes med forbedret spatiotemporal oppløsning 17-19. Dette er i det minste delvis fordi en tredimensjonal binding prosessen er i det vesentlige redusert til to avbildnings dimensjoner, særlig ved opptak i støy dempes TIRF modus. Bruken av SLBs er kompatibel med enkelt molekyl signal deteksjon, en forutsetning for foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM), dvs. superresolution mikroskopi med en oppløsning under diffraksjonsgrensen 15,16. Disse spesielle bildediagnostikk enable enkelt molekyl Förster Resonance Energy Transfer eksperimenter designet for å visualisere individuelle protein-protein interaksjoner i en synaptisk miljø 20. Denne tilnærmingen er forklart i stor detalj i en Jove publikasjon kalt "Measuring TCR-pMHC bindende bruker en FRET basert mikros analysen" 21.
Ved tolkning SLB-baserte eksperimenter man bør alltid huske på at ikke alle egenskapene til en plasma membran av en levende celle er kjennetegnet ved SLBs, og at noen av de manglende kvaliteter kan påvirke fysiologi under etterforskning. Tross alt, er SLB-integrerte proteiner fritt spre og ikke organisert i membranmikroområder som de fleste av sine cellulære kolleger er 5,6,22. Immobilisert plasma-membraner avledet fra adherente celler som bevarer plasmamembranen arkitekturen av levende celler til en viss grad, er med hell anvendt for å studere opptak fra membran innleiret antigener av B-lymfocytter 23. Men selv et sliktmembraner har ikke samvirke med et høyt dynamisk cytoskjelett og har ingen fleksibilitet som de er understøttet av en stiv glassflaten. I lys av disse avvikene er det helt klart et behov for prosjektering SLBs, som tilbyr hjelp til fordeler proteiner i en definert måte, og som støttes av overflater av justerbar fleksibilitet eller flater som endrer deres stivhet i respons til lokalt anvendt lyspulser.
The authors have nothing to disclose.
MA ble støttet av en Schrödinger fellesskap av den østerrikske Science Fund (FWF, J3086-B11) og takker Max-Planck-Society for økonomisk og administrativ støtte. GS ble støttet av Wien Science and Technology Fund (WWTF, LS13-030). JH ble støttet av Wien Science and Technology Fund (WWTF, LS14-031).
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |