Summary

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması<em> Drosophila</em

Published: September 30, 2015
doi:

Summary

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Abstract

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.

Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Introduction

Bu prosedürün amacı, Drosophila melanogaster'in kullanılmasının metabolomiks çalışmalar için yeterli mitokondriyal metabolitleri elde zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar geliştirmektir. Bizim tecrübelerimize göre, tüm hücresel çıkarma yöntemlerini kullanarak metabolomik analiz Drosophila ince mitokondriyal metabolit değişikliklerini tespit edemiyoruz. Ancak önceki metabolomik analiz mitokondriyal fraksiyon mitokondriyal metabolit vardiya tanımlamak için hassasiyetini artırır.

Mitokondri hücreleri normal fonksiyon 1 için gereken enerjinin% 90 sağlanmasından sorumlu hücresel organellerdir. Son yıllarda bu mitokondrinin sadece adenozin trifosfat (ATP) üretmek daha hücresel ve organizma işlevi çok daha dinamik bir rol oynayabilir ve şimdi metabolik homeostazı 2,3 düzenlenmesi için hub olarak tanınan kabul edilmiştir. Mitokondri dis olan bir endosimbiyotik işleminin sonucudurTinct mikrobik soy 1,5 milyar yıl önce 4 ~ birleşti. Mitokondri gerçek organellere haline gibi, endosymbiont gelen genler ortaya çıkan nükleer genomu dahil edildi. 37 gen oksidatif fosforilasyon 5 enzim komplekslerinin alt birimleri olan mitokondriyal proteinleri kodlayan 13 olan mtDNA, kalırken hayvanlarda bugün yaklaşık 1.500 mitokondriyal proteinlerin, nükleer kodlanmış bulunmaktadır. Mitokondri ve nükleer bölmeleri arasında koordinasyon düzgün mitokondriyal fonksiyonunu korumak için gereklidir.

Burada açıklanan yöntemleri kullanarak mitokondriyal ve nükleer genomlarındaki arasındaki koordinasyon manipülasyon sonucu Drosophila mitokondriyal metabolik değişiklikleri tespit etmek mümkün. Biz hangi mtDNA D. kardeş türünden Drosophila bir yük kullanılan simulans tek D. yerleştirildi Nükleer arka plan 6 melanogaster. Bu "kesintiye 'mitonuclearGenotip D. 'doğal', ya da ko-evrimleşmiş mitonuclear genotip ile karşılaştırılmıştır kendi doğal D. ile aynı nükleer genomu taşıyan melanogaster mtDNA melanogaster. D. melanogaster ve D simulans mtDNAs 100 ~ tarafından amino asitler ve mitonuclear iletişim 7,8 etkileyen> 500 eşanlamlı değiştirmelerin farklıdır. Biz farmakolojik strese yanıt olarak metabolit vardiya çalışmak için tüm sinek özleri ve mitokondriyal zenginleştirilmiş özleri üretti. Burada mitokondrial zenginleştirilmiş kesirler kullanırken biz D. taşıyan yerli, eş-evrim genotip arasındaki mitokondriyal metabolitleri belirgin değişimler tespit olduğunu göstermektedir melanogaster mtDNAs ve D. taşıyan kesintiye genotip simulans mtDNA. Buna karşılık, bu iki genotipleri arasındaki metabolit değişiklikleri tüm sinek özü kullanan, normal yöntemlerle ince olur. Bu nedenle, bu yöntem mtDNAs mitokondriyal değişiklikler arabuluculuk nasıl anlamak için bir yol sağladıFarklı ilaçlara yanıt.

Protocol

1. Reaktifler ve Çözümleri Sinek gıda ve medya hazırlanması Isı uçucu bileşenler 90 ° C 'ye ayarlanmış bir ocak su içinde ağırlık / hacim olarak% 0.79 agar% 11 şeker,% 2 otolize uğramış mayası,% 5.2 mısır unu. Homojen biraz yoğun karışım elde edilinceye kadar düzenli olarak karıştırın. Her bir yiyecek kalkan 5 ml ile 100 şişelerde bir toplam uçucu gıda 550 ml'lik bir nihai hacim hazırlayın. Isıtma cihazından çıkar Gıda aşağı 80 ° C'…

Representative Results

Protokol Yukarıda açıklandığı kullanarak, farklı mtDNAs 7 rapamisin ilacın etkisini test etmek için, mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonları ve bütün hayvansal özler üzerine metabolomic analizi yapıldı. Biz sinek gıda ilaç çözerek rapamisinin 200 mcM teslim etti. Sinekler için 10 gün rapamisin maruz bırakılmıştır. Bütün uçucu ekstrelerinden ve mitokondriyal ekstrelerinden metabolitleri standart çözücü çıkarma yöntemleri kullana…

Discussion

Bu protokolde en kritik adımlar şunlardır: 1) bol uzayda yeterli sinekler yetiştirme. 150'den fazla sinekler her biri demografi kafesleri overpopulate değil çok önemlidir; 2) sık sık gıda rekabeti ve beslenme stresi önlemek için kafes gıda değişen; ve 3), 4 ° C 'de, tüm numuneler muhafaza mitokondriyal fraksiyonunun izolasyonu sırasında bütünlüğünü sağlamak için. Ayrıca yalıtım tamponu, yıkama tamponu ve kullanımdan önce kullanılan cam teflon homojenleştirici soğuk Dounce tavs…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.

Materials

0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate  VWR AAA14289
Ethanol Sigma-Aldrich 792799
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) Sigma-Aldrich M1254 
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 38057 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich 5470
KCL Sigma-Aldrich P9333
Tris HCL  Sigma-Aldrich RES3098T-B7
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1551139
CO2 pads to anesthetize flies Tritech Research MINJ-DROS-FP
1 liter cage  Web Restaurant Store 999RD32
1 liter cage lid  Web Restaurant Store 999LRD
a glass-teflon dounce homogenizer  Fisher Scientific NC9661231
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
rapamycin  LC Laboratories  R-5000
anti-porin MitoSciences MSA03
anti-alpha tubulin Developmental Studies Hybridoma Bank 12G10
Pierce™ BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific  23225
CO2 pad Tritech Research, Inc MINJ-DROS-FP
filter flask enasco SB08184M
rubber stopper enasco S08512M

References

  1. Scheffler, I. E. . Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , 484 (2007).
  2. Guarente, L. Mitochondria–a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
  3. Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
  4. Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
  5. Lane, N., , . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, (2006).
  6. Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
  7. Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
  8. Zhu, C. -. T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
  9. Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
  10. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  11. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
  12. Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
  13. Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).

Play Video

Cite This Article
Villa-Cuesta, E., Rand, D. M. Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila. J. Vis. Exp. (103), e53149, doi:10.3791/53149 (2015).

View Video