Summary

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב<em> דרוזופילה</em

Published: September 30, 2015
doi:

Summary

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Abstract

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.

Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Introduction

המטרה של הליך זה היא לפתח שברים המיטוכונדריה מועשרות שיניבו מספיק מטבוליטים המיטוכונדריה ללימודי metabolomics באמצעות melanogaster תסיסנית. מניסיוננו, metabolomics ניתוח תוך שימוש בשיטות מיצוי סלולארי כל אינם מסוגלים לזהות שינויי המטבוליט המיטוכונדריה עדינים בדרוזופילה. עם זאת, fractioning המיטוכונדריה לפני ניתוח metabolomics מגביר את הרגישות לזהות משמרות המטבוליט המיטוכונדריה.

המיטוכונדריה הם אברונים תאיים אחראים על מתן 90% מהאנרגיה שתאים צריכים לתפקוד נורמלי 1. בשנים האחרונות זה כבר הכיר בכך שהמיטוכונדריה לשחק הרבה יותר דינמי תפקיד בתפקוד תאי והאורגניזם מאשר רק ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP), וכעת הם מוכרים כרכזות להסדרת 2,3 הומאוסטזיס חילוף חומרים. המיטוכונדריה הוא התוצאה של תהליך שבו endosymbiotic דיסשושלות חיידקי tinct התמזגו ~ לפני 1.5 מיליארדים שנים 4. כמיטוכונדריה התפתחה לאברונים אמיתיים, גנים מאנדוסימביוזה שולבו בגנום הגרעיני המתפתח. בבעלי חיים היום, כ -1,500 חלבוני המיטוכונדריה הם בקידוד גרעיניים תוך 37 גנים להישאר בmtDNA, 13 מהם לקודד חלבוני המיטוכונדריה שהם תת-יחידות של מתחמי האנזים של זרחון חמצוני 5. יש צורך בתיאום בין המיטוכונדריה ותאים גרעיניים כדי לשמור על תפקוד המיטוכונדריה נכון.

שימוש בשיטות שתוארו כאן היינו מסוגל לזהות שינויים מטבוליים המיטוכונדריה בתסיסנית הנובעים ממניפולציה של התיאום בין הגנום המיטוכונדריאלי והגרעיני. אנחנו השתמשנו בזן של דרוזופילה בי mtDNA ממיני אחותה ד simulans הונח על ד בודד melanogaster רקע גרעיני 6. mitonuclear 'שיבש' זהגנוטיפ הושווה לגנוטיפ mitonuclear 'הילידים', או-התפתח שיתוף של ד melanogaster נושא את אותו הגנום גרעיני עם ד המקורי שלו melanogaster mtDNA. ד melanogaster וד ' simulans mtDNAs שונה על ידי ~ 100 חומצות אמינו ו> 500 החלפות נרדפים המשפיעות 7,8 תקשורת mitonuclear. אנחנו שנוצרנו תמציות לטוס כל ותמציות מועשרות המיטוכונדריה ללמוד משמרות המטבוליט בתגובה ללחץ תרופתי. כאן אנו מראים כי בעת שימוש שבברי המיטוכונדריה המועשרת לזהות שינויים בולטים במטבוליטים המיטוכונדריה בין גנוטיפ נשא ד הילידים, התפתח-שיתוף mtDNAs melanogaster וגנוטיפ שיבש נשא ד simulans mtDNA. לעומת זאת, שינויי המטבוליט בין שני גנוטיפים אלה הם עדינים תוך שימוש בשיטות רגילות לנצל תמצית לטוס כולה. לכן, שיטה זו סיפקה דרך להבין כיצד mtDNAs לתווך שינויי המיטוכונדריה בתגובה לתרופות שונות.

Protocol

1. ריאגנטים ופתרונות הכנת מזון זבוב ותקשורת מרכיבים לטוס חום סוכר 11%, 2% שמרי autolyzed, קמח תירס 5.2%, אגר 0.79% w / v במים בפלטה חשמלית נקבעה על 90 מעלות צלזיוס. מערבבים באופן קבוע עד …

Representative Results

שימוש בפרוטוקול שהוסבר לעיל, ביצענו ניתוח metabolomic על שברים מועשרות המיטוכונדריה ותמציות בעלי חיים שלמות כדי לבדוק את ההשפעה של התרופה על Rapamycin mtDNAs מסתעף 7. אנו נמסרו 200 מיקרומטר של rapamycin ידי המסת התרופה במזון הזבוב. זבובים נחשפו לRapamycin במשך 10 י?…

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם: 1) גידול מספיק זבובים בחלל בשפע. זה מאוד חשוב שלא לגרום להתפוצצות אוכלוסין כלובי דמוגרפיה עם יותר מ -150 זבובים כל אחד; 2) שינוי המזון של הכלובים לעתים קרובות כדי למנוע תחרות מזון ומתח תזונתי; ו 3) שמירה על כל הדגימות ב 4 ° C כדי להבטיח א…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.

Materials

0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate  VWR AAA14289
Ethanol Sigma-Aldrich 792799
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) Sigma-Aldrich M1254 
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 38057 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich 5470
KCL Sigma-Aldrich P9333
Tris HCL  Sigma-Aldrich RES3098T-B7
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1551139
CO2 pads to anesthetize flies Tritech Research MINJ-DROS-FP
1 liter cage  Web Restaurant Store 999RD32
1 liter cage lid  Web Restaurant Store 999LRD
a glass-teflon dounce homogenizer  Fisher Scientific NC9661231
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
rapamycin  LC Laboratories  R-5000
anti-porin MitoSciences MSA03
anti-alpha tubulin Developmental Studies Hybridoma Bank 12G10
Pierce™ BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific  23225
CO2 pad Tritech Research, Inc MINJ-DROS-FP
filter flask enasco SB08184M
rubber stopper enasco S08512M

References

  1. Scheffler, I. E. . Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , 484 (2007).
  2. Guarente, L. Mitochondria–a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
  3. Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
  4. Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
  5. Lane, N., , . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, (2006).
  6. Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
  7. Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
  8. Zhu, C. -. T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
  9. Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
  10. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  11. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
  12. Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
  13. Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).

Play Video

Cite This Article
Villa-Cuesta, E., Rand, D. M. Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila. J. Vis. Exp. (103), e53149, doi:10.3791/53149 (2015).

View Video