Summary

Determinazione Preferenze ultrasuoni vocalizzazione nei topi utilizzando un test di riproduzione a due scelta

Published: September 03, 2015
doi:

Summary

Ultrasonic vocalizations (USVs) in mice differ depending on age, sex, condition, and genetic background. Using two ultrasound emitters broadcasting simultaneously in different locations, this two-choice test can evaluate murine recognition and preference responses to different characteristics of USVs.

Abstract

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, sex, condition, and genetic background of the emitting animal. Although many studies have characterized these differences, whether receiver mice can discriminate among objectively different USVs and show preferences for particular sound traits remains to be elucidated. To determine whether mice can discriminate between different characteristics of USVs, a playback experiment was developed recently, in which preference responses of mice to two different USVs could be evaluated in the form of a place preference.

First, USVs from mice were recorded. Then, the recorded USVs were edited, trimmed accordingly, and exported as stereophonic sound files. Next, the USV amplitudes generated by the two ultrasound emitters used in the experiment were adjusted to the same sound pressure level. Nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitters were used to play the USVs back. Finally, to investigate the preference of subject mice to selected USVs, pairs of two differing USV signals were played back simultaneously in a two-choice test box. By repeatedly entering a defined zone near an ultrasound emitter and searching the wire mesh in front of the emitter, the mouse reveals its preference for one sound over another. This model allows comparing the attractiveness of the various features of mouse USVs, in various contexts.

Introduction

Molti animali usano vocalizzazioni per la comunicazione intraspecifica. Nel topo Mus musculus, uno importante tipo di segnale di comunicazione è vocalizzazioni ultrasoniche (USV), che hanno frequenze superiori a 20 kHz. USV emessi dai topi sono considerati una componente di riconoscimento sociale in maschio-femmina 1-4, femmina-femmina 1, 5, e maschio-maschio 1, 6 interazioni. USV vengono emessi anche da cuccioli quando sono isolate dalla loro madre, che aumenta il suo comportamento-pup recupero, e di conseguenza la sopravvivenza Pup 7. Anche se molti studi hanno analizzato e classificato USV del mouse 8, 9, le risposte comportamentali e meccanismi neurali dell'animale ricevente sono stati meno documentati 10, 11. Quest'ultimo è necessario per chiarire il significato biologico delle diverse caratteristiche di USV. Per rivelare questi meccanismi, l'esperimento di riproduzione è un metodo efficiente. Studi di riproduzione recenti hanno rivelato che femminilei topi sono attratti da USV 12, e che preferiscono USV da maschi che sono diversi dai loro genitori 13, 14.

Questo articolo spiega il test di riproduzione utilizzato per valutare USV preferenza nei topi. Una scatola test a due scelta è stata sviluppata in cui due USV differenti possono essere riprodotte contemporaneamente in due compartimenti di un contenitore di prova, come illustrato in Figura 1. Questo tipo di scatola di prova impedisce la contaminazione suono dividendo l'area di prova in tre sottocamere , con muri di piombo. Gli emettitori di ultrasuoni si trovano al di fuori di ogni stanza. Nel muro tra le camere e emettitori di ultrasuoni sono buchi coperti di rete metallica. Topi può muoversi liberamente nelle tre sale, e mostra una "ricerca della rete" comportamento, come se per rispondere a USV riprodotte dagli emettitori di ultrasuoni. In questo test, i topi soggiornare per periodi di durata diversa vicino a un emettitore sonoro o l'altro. Questi parametri possono essere registrati per ottenere un sensibile misu re di preferenza suono.

Per riprodurre i USV indietro, silicio nanocristallino emettitori termo-acustico (cioè, "emettitore nc-Si"), sono stati utilizzati come in studi precedenti 15-17. Questi dispositivi sono composti da un elettrodo a film sottile riscaldatore, uno strato di silicio poroso nano, e un wafer di silicio monocristallino. Il file audio digitale viene convertito in un segnale analogico e poi fatto passare attraverso l'elettrodo riscaldatore. Il dispositivo converte i segnali termici derivanti voltaggio-dipendenti in significativo di pressione sonora con bassa distorsione. Questo dispositivo è unico in quanto, a differenza di generatori di suoni comuni che dipendono da vibrazioni meccaniche, può riprodurre il suono senza la necessità di un diaframma. L'emettitore presenta un livello di pressione sonora piatta a frequenze da 20 a 160 kHz (figura 2), e può riprodurre USV murini digitalmente registrate molto accuratamente in termini di durata, frequenza e livello sonoro di pressione 15, 18, ​​19.

ve_content "> In un esperimento rappresentativo mostrato in Figura 3, C57BL / 6 (B6) femmine hanno permesso di scegliere tra BALB / c (BALB) USV maschi e rumore di fondo. Inoltre, la Figura 4 mostra la scelta delle femmine B6 e BALB tra riproduzioni USV simultanee da un topo BALB e un maschio B6, come riportato in un precedente studio 14. Le caratteristiche di USV maschili differiscono B6 e BALB ceppi 20. Come mostrato da questi risultati, l'attrattiva di USV può essere valutata con il presente protocollo, in cui i suoni sono registrati da un individuo dal vivo, acusticamente analizzati e riprodotti ad altri individui.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico di Azabu University. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in una camera insonorizzata. 1. Preparazione degli animali Maschi per la registrazione Ottenere topi maschi sessualmente maturi esperienza in accoppiamento. Soggetti di sesso femminile Ottenere vergine topi femmina che hanno ospitato da 2 a 5 fratellini per gabbia (di solito 8 – 12 settimane). Ottenere stris…

Representative Results

I USV registrate da un topo BALB-maschio (161 sillabe per 20 sec), così come rumore di fondo sono stati utilizzati come riprodurre suoni nell'esperimento rappresentante illustrato nella figura 3. In questo esperimento, 7 topi B6 femminili sono stati usati a 9 settimane di età . Per determinare la migliore durata della prova della risposta femminile di riproduzione suoni, i parametri comportamentali sono state analizzate separatamente per i primi e gli ultimi cinque minuti del tempo di collaudo tot…

Discussion

Here, the results of a representative test showed that female mice can discriminate between artificial male USVs and background noise (Figure 3). The conclusion to be drawn from these results is that the discrimination signal is reflected in the duration of stay in the room and sound zone, and in the duration of searching the mesh in the first 5 min of testing, but not in the second 5 min (Figure 3C, E and F). These data indicate that mice become habituated to the playback sounds, possib…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa-in-Aid per JSPS Fellows a AA; da sovvenzioni-in-Aid per la Ricerca Scientifica sulle zone innovative per JSP Fellows (n 4501 e n 25.132.712) di TK; e da una borsa di progetto di ricerca assegnato dalla Azabu University. figura 2 è ristampato da Kihara, T., Harada, T., e Koshida, N. Wafer-compatibile fabbricazione e le caratteristiche del silicio nanocristallino emettitori di ultrasuoni indotte termicamente. In: Sensori e Attuatori A: fisiche, volume 125, Elsevier, pag. 426, (2006), con il permesso di Elsevier.

Materials

Soundproof chamber Muromachi Kikai
Small cage CLEA Japan CL-0113-1
Middle cage CLEA Japan CL-0103-1
Ultrasound condenser microphones Avisoft Bioacoustics CM16/CMPA
A/D converter Avisoft Bioacoustics UltraSoundGate116H
Audio software Avisoft Bioacoustics RECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / Audio editing software Adobe Systems Adobe Audition 3.0
Nc-Si emitter Original not commercially available but it is planned to be so in near future
D/A converter National Instruments NI USB-6251 BNC
Attenuator Original
Amplifier Yamatake
PC Windows 7 professional Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system
Event recorder Excel-macro / Event-scoring software original Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto
CCD Camera
Rubber plates (made of elastomer resin) Tokyo bouon TI-75BK B4 Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
Giemsa's azur eosin methylene blue solution Merck Millipore 1.09204.0500

References

  1. Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PLoS One. 2 (4), e351 (2007).
  2. Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T+tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10 (1), 44-56 (2010).
  3. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
  4. Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PLoS One. 9 (5), e97244 (2014).
  5. Amato, F. R., Moles, A. Ultrasonic vocalizations as an index of social memory in female mice. Behav. Neurosci. 115 (4), 834-840 (2001).
  6. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
  7. Ehret, G. Infant rodent ultrasounds–a gate to the understanding of sound communication. Behav. Genet. 35 (1), 19-29 (2005).
  8. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (1), e386 (2005).
  9. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46 (1), 28-34 (2007).
  10. Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136 (6), 3401 (2014).
  11. Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PLoS One. 9 (1), e85405 (2014).
  12. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic ‘songs’ with approach behaviour. Biol. Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  13. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice, Mus musculus musculus. Anim. Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  14. Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in iice. PloS one. 9 (2), e87186 (2014).
  15. Uematsu, A., et al. Maternal approaches to pup ultrasonic vocalizations produced by a nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitter. Brain Res. 1163, 91-99 (2007).
  16. Okabe, S., et al. The effects of social experience and gonadal hormones on retrieving behavior of mice and their responses to pup ultrasonic vocalizations. Zoolog. Sci. 27 (10), 790-795 (2010).
  17. Okabe, S., et al. Pup odor and ultrasonic vocalizations synergistically stimulate maternal attention in mice. Behav. Neurosci. 127 (3), 432-438 (2013).
  18. Shinoda, H., Nakajima, T., Ueno, K., Koshida, N. Thermally induced ultrasonic emission from porous silicon. Nature. 400 (6747), 853-855 (1999).
  19. Kihara, T., Harada, T., Koshida, N. Wafer-compatible fabrication and characteristics of nanocrystalline silicon thermally induced ultrasound emitters. Sensor. Actuat. A-Phys. 125 (2), 422-428 (2006).
  20. Kikusui, T., et al. Cross fostering experiments suggest that mice songs are innate. PloS One. 6 (3), e17721 (2011).
  21. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389 (2012).
  22. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  23. Tomihara, K., et al. Effect of ER-beta gene disruption on estrogenic regulation of anxiety in female mice. Physiol. Behav. 96 (2), 300-306 (2009).
  24. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R. Hearing loss associated with the modifier of deaf waddler (mdfw) locus corresponds with age-related hearing loss in 12 inbred strains of mice. Hear. Res. 154 (1-2), 45-53 (2001).
  25. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  26. Grimsley, J. M., Monaghan, J. J., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PLoS One. 6 (3), e17460 (2011).
  27. Sugimoto, H., et al. A role for strain differences in waveforms of ultrasonic vocalizations during male-female interaction. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  28. Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PLoS One. 7 (7), e40782 (2012).
  29. Wang, H., Liang, S., Burgdorf, J., Wess, J., Yeomans, J. Ultrasonic vocalizations induced by sex and amphetamine in M2, M4, M5 muscarinic and D2 dopamine receptor knockout mice. PLoS One. 3 (4), (2008).
  30. Moles, A., Kieffer, B. L., D’Amato, F. R. Deficit in attachment behavior in mice lacking the mu-opioid receptor gene. Science. 304 (5679), 1983-1986 (2004).
  31. Hiramoto, T., et al. Tbx1: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse. Hum. Mol. Genet. 20 (24), 4775-4785 (2011).
  32. Ey, E., et al. Absence of deficits in social behaviors and ultrasonic vocalizations in later generations of mice lacking neuroligin4. Genes Brain Behav. , (2012).
  33. Roy, S., Watkins, N., Heck, D. Comprehensive analysis of ultrasonic vocalizations in a mouse model of fragile X syndrome reveals limited, call type specific deficits. PLoS One. 7 (9), e44816 (2012).

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Cite This Article
Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback Test. J. Vis. Exp. (103), e53074, doi:10.3791/53074 (2015).

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