Wijze van Studeren Palatal Fusion met statische Organ Cultuur
Summary
Studies van gehemelte ontwikkeling worden gemotiveerd door de incidentie van gespleten gehemelte, een aangeboren afwijking die een enorme gezondheid last oplegt en kunnen verlaten blijvende verminking. We tonen hier een techniek om cultuur palatini die kunnen worden gebruikt om verschillende signaalwegen betrokken bij palatinale ontwikkeling en fusie bestuderen.
Abstract
Schisis behoren tot de meest voorkomende van alle aangeboren afwijkingen. De secundaire gehemelte vormen van mesenchymale planken bedekt met epitheel die voldoet aan de middellijn epitheliale naad (MES). De theorieën suggereren dat MES cellen volgen een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), apoptose en migratie, het maken van een gesmolten smaak 1. Volledige desintegratie van de MES is de laatste essentiële fase van palatal samenloop met omliggende mesenchymale cellen. Wij bieden een methode voor het gehemelte orgelcultuur. De ontwikkelde in vitro protocol maakt het onderzoek mogelijk van het biologische en moleculaire processen tijdens fusion. De toepassingen van deze techniek zijn talrijk, inclusief het evalueren respons op exogene chemische agentia, van regulerende en groeifactoren en eiwitten. Palatal orgelcultuur heeft een aantal voordelen, waaronder manipulatie in verschillende stadia van ontwikkeling die niet mogelijk is met in vivo studies.
Introduction
Orofacial kloven zijn de meest overheersende craniofaciale aangeboren afwijkingen. Ook rekening houdend met alle mogelijke craniofaciale afwijkingen, dit zijn de tweede meest voorkomende geboorte afwijkingen bij pasgeborenen 2. Gespleten gehemelte optreden bij ongeveer 1 op elke 700 geboorten in de Verenigde Staten (VS) per jaar, de incidentie van gespleten gehemelte is gelijk aan 475 kinderen geboren met een gespleten gehemelte per maand of 15 kinderen met spleten per dag 3. Ongeveer 1% van de kinderen geboren in de wereld elk jaar vertonen een bepaalde vorm van craniofaciale dysmorfologie.
Spleten van het gehemelte en de lip hebben een zeer dure en ingewikkelde procedure levenslange gevolgen voor patiënten die deze anomalie. De geschatte kosten voor elke patiënt met orale gespleten is ongeveer $ 100.000 4. De behandeling van een patiënt met schisis vereist een team van artsen, waaronder craniofaciale chirurgen, otolaryngologists, genetici, anesthesisten,spraak-taal pathologen, voedingsdeskundigen, orthodontisten, prosthodontists, psychologen, neurochirurgen en oogartsen.
In palatogenesis de secundaire gehemelte rijst gepaarde uitwassen, die aanvankelijk verticaal groeien ondergaan palatale elevatie boven het dorsum van de tong. Na verhoging, de gepaarde palatal schappen groeien naar de middellijn (op E14.5 -E15 bij muizen en week 9 bij de mens). De mediale rand epitheel (MEE), die de plank tip dekt houdt zich het vormen van de middellijn epitheliale naad.
Dit wordt gevolgd door epitheliale naar mesenchymale overgang en / of apoptose laten mesenchymale confluentie. Hechting van tegengestelde MEE is een belangrijk evenement waarvan wijziging veroorzaakt gespleten gehemelte. Echter, slechts weinig studies onderzochten de initiële hechting van palatal planken 5. Het harde gehemelte vormen door differentiatie van mesenchymale cellen in osteoblasten. De abnormale ontwikkeling van het gehemelte kunnen sleutel producerent smaakpapillen met of zonder betrokkenheid van de lip.
Gehemelte orgelcultuur technieken werden op grote schaal gebruikt voor vele laboratoria in de afgelopen 30 jaar 6,7.
In dit protocol beschrijven we in detail een werkwijze palatale dissectie en statische orgaankweek. Het voordeel van een bewegingloze orgaankweek is dat het mogelijk palatini fuseren. Deze techniek werd met succes gebruikt in ons laboratorium voor vele fusie-experimenten en signalering 8,9. Het toepassingsgebied van de techniek is enorm en kan worden gebruikt als statische orgaankweek systeem nodig en een evaluatie van respons op exogene chemische stoffen, de gevolgen van regulerende groeifactoren in verschillende trajecten en specifieke eiwitten.
Figuur 1. Mouse Palatogenesis. Ontwikkelingsstadia van de muizen gehemelte. (BF) Scanning elecTRON microfoto (SEM) van de secundaire gehemelte bij representatief ontwikkelingsstoornissen tijden. Rode pijlen: tonen de oorspronkelijke deel van palatale hechting en fusion. Gele pijlen wijzen op de ruimte tussen de primaire en secundaire fijnproevers die zal verdwijnen na fusie (herdrukt van Kaufman 11 met toestemming van PLoS ONE).
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol in dit artikel een werkwijze voor het ontleden palatal planken uit embryo's op embryonale dag 13,5. Palatini van muizenembryo's werden gekweekt in een serumvrij kweekmedium in een atmosfeer van 95% O 2 5% CO2 bij 37 ° C. Succesvol palatinale dissectie kritisch afhankelijk van meerdere factoren bij elke stap tijdens de procedure van de embryonale moment van de muizen gedood om de voltooiing van de kweek. Een van de belangrijkste factoren palatinale fusie is de tijd voor de orge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have any acknowledgements.
Materials
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100x15mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60×15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| Co2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 | |
References
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, . principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. . Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).
- Kaufman, M. H. . The Atlas of Mouse Development. , (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).
