Enfoque genético adelante para descubrir Estrés Los genes de resistencia en ratones - Una pantalla de alto rendimiento en células madre embrionarias
Summary
Resistencia al estrés es una de las señas de identidad de la longevidad y es conocido por ser gobernado genéticamente. Aquí, hemos desarrollado un método de alto rendimiento imparcial para la detección de mutaciones que confieren resistencia al estrés en células madre embrionarias con el que desarrollan modelos de ratón para estudios de longevidad.
Abstract
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Introduction
La longevidad tiene una íntima relación con la resistencia al estrés. En general, las especies de larga vida a menudo muestran una mayor resistencia a múltiples factores de estrés, como el peróxido de hidrógeno, el paraquat (PQ), UV, calor, y metales pesados 1,2. Por el contrario, el aumento de la sensibilidad al estrés tiende a predecir acortada duración de la vida y / o un fenotipo más propenso a la enfermedad. La vía de eliminación de anti-oxidante mucho tiempo se ha especulado que desempeñar un papel importante en el estrés que confiere resistencia al animal. Sin embargo, con pocas excepciones, los estudios de una variedad de animales transgénicos con manipulaciones en varias enzimas antioxidantes (por ejemplo, SOD) indican que el aumento del nivel de las enzimas oxidantes de barrido no aumenta la vida útil o la duración de la salud 3. Estos datos sugieren que el rasgo de resistencia al estrés observado consistentemente en animales de larga vida está mediada por otras vías celulares aún no se ha descubierto.
Tomamos un avance imparcialenfoque genético para identificar genes, que tras la mutado, puede conferir un fenotipo de resistencia a la tensión en las células madre embrionarias cultivadas (ES). Células ES ofrecen dos ventajas importantes en este estudio: (1) las manipulaciones genéticas sofisticados están disponibles para modificar el genoma de las células ES; y (2) cualesquiera células ES resistentes a estrés recuperados de la pantalla se pueden utilizar directamente para la producción de ratón, que permite la traducción rápida en los estudios en animales enteros para medir duración de la vida y la duración de la salud.
En este informe, se describe el uso de la línea celular de C9 ES, en el que los alelos Blm estaban bajo el control de un elemento sensible a la tetraciclina. El tratamiento de doxiciclina (dox) transitoriamente apagó la expresión de Blm que representan un aumento de incidentes de intercambio de cromátidas hermanas. Este corto plazo Blm Knock-Out permitido para la generación de mutaciones homocigóticas dentro de la población heterocigoto para que mutaciones recesivas para la resistencia al estrés podrían ser capturados en el proceso de selección. NosotrosTambién se describe el uso de piggyBac (PB) transposón como el mutágeno para insertar aleatoriamente un poli-A trampa de casete (PB-UPA) para mutar genes en el genoma. Las células con alteración de un gen por la poli-Una trampa convirtieron G418 resistentes y pueden ser recuperados de manera que una colección de mutantes gen-trampa (gen-trampa de biblioteca) se podría hacer, y posteriormente se proyectó para los clones mutantes que eran resistentes estrés.
Los clones resistentes a estrés recuperados de la selección se podrían caracterizar con bastante rapidez por técnicas moleculares con respecto del número de inserciones (qPCR), el sitio de inserción (splinkerette PCR), la identidad del gen alterado (BLAST), y su nivel de expresión ( RT-qPCR). La inserción PB podría removilizado por la expresión transitoria de MPB transposasa en el clon para restaurar la secuencia de ADN de tipo salvaje y por lo tanto la prueba de la pérdida de resistencia al estrés. Estas son formas poderosas para confirmar la causalidad de la mutación, que se deben hacer antesa la producción de ratón caro. Estudios anteriores demostraron que las células expuestas a factores estresantes perdieron 4,5 pluripotencia. Por lo tanto, en este protocolo, la preservación de un conjunto de réplicas de células mutantes, que no se puede tratar con los factores de estrés es fundamental para la producción exitosa de ratón.
Nuestro laboratorio ha diseñado la línea celular de C9 ES y el vector PB-UPA, ambos están a disposición de otros investigadores que lo soliciten. El protocolo informó aquí se iniciará por la generación de novo de la biblioteca de genes de las células ES-atrapado con PB-UPA (Figura 1A), seguido por réplica en placa y la selección de estrés para aislar clones resistentes de estrés (Figura 1B). Hemos demostrado la selección con paraquat, un potente generador de radicales libres en las células. Prácticamente, cualquier compuesto citotóxico o una toxina, por ejemplo, factores de estrés ER (por ejemplo, thapsigargin y tunicamicina), oxidante neuronal (por ejemplo, MPP +, la dopamina 6-hidroxi, y rotenona), el calor, y pesadometales (por ejemplo, CD, Se), podrían adaptarse para el método para seleccionar para mutantes resistentes respectivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Materials
| Vector | ||
| PB-UPA | ||
| mPBase | ||
| mPBasePuro | ||
| Tissue Culture | ||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
| T25 Flask | Corning | 353108 |
| T75 flask | Corning | 353135 |
| 100-mm plate | Corning | 353003 |
| 150-mm plate | Corning | 430599 |
| 96-well plate | Corning | 3585 |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
| 24-well plate | Corning | 3526 |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | |
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
| Electroporation | ||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
| Molecular Biology | ||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
| Electrophoresis | ||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
| 1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |
References
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