Summary

Вперед генетический подход к Раскройте стрессоустойчивости генов в мышах - высокой пропускной экране в ЭС клетках

Published: November 11, 2015
doi:

Summary

Стрессоустойчивость является одним из признаков долголетия и, как известно, генетически регулируется. Здесь мы разработали метод объективную высокой пропускной для выявления мутаций, которые придают устойчивость к стрессам в ЭС клеток для разработки модели мыши для долголетия исследований.

Abstract

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Introduction

Стаж имеет интимные отношения с стрессоустойчивости. В общем, долгоживущие виды часто демонстрируют повышенную устойчивость к нескольким стрессовых, таких как перекись водорода, паракват (PQ), УФ, тепла и тяжелых металлов 1,2. В противоположность этому, повышенная чувствительность к стрессу, как правило, предсказать сокращению срока службы и / или более фенотип болезни подверженных. Антиоксидант вывоз мусора путь уже давно предположили, играть важную роль в придании стрессоустойчивость животному. Тем не менее, с некоторыми исключениями, исследования из различных трансгенных животных с манипуляциями в различных антиокислительных ферментов (например, SOD) показывают, что увеличение уровня окислительных ферментов, поглощающих не увеличивает продолжительность жизни или здоровья продолжительность 3. Эти данные позволяют предположить, что стресс признак устойчивости последовательно наблюдается в долгоживущих животных посредничестве других клеточных путей еще не обнаружили.

Мы взяли объективную впередгенетический подход к идентификации генов, которые при, мутировал, может придать стрессоустойчивости фенотип в культуре эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. ЭС клетки предлагают два основных преимущества в этом исследовании: (1) сложные генетических манипуляций можно изменить геном ЭС клеток; и (2) любые устойчивые стресс ЭС клетки, выделенные из экрана могут быть непосредственно использованы для производства мыши, позволяя быстро перевод на целых исследований на животных для измерения продолжительности жизни и здоровья промежуток.

В этом докладе мы описали использование клеточной линии ES С9, в котором BLM аллелей под контролем с помощью тетрациклину элемента. Лечение доксициклина (DOX) временно отключен выражение Blm ведущую к увеличению инцидента сестра хроматид обмена. Эта краткосрочная BLM нокаут, разрешенных для производства гомозиготных мутаций в популяции гетерозиготного так, что рецессивные мутации для стрессоустойчивости может быть захвачен в процессе отбора. МыТакже описано применение PiggyBac (PB) транспозона мутагенеза случайно вставить поли-ловушка кассету (ПБ-УПА) мутировать генов в геноме. Клетки с нарушением гена, по поли-ловушка стал резистентные к G418, и могут быть восстановлены, так что совокупность генов ловушки мутантов (библиотеки генов-ловушка) может быть, а затем скрининг на мутант клонов, которые были устойчивы стресса.

Стресс резистентные клоны, выделенные из выбора можно охарактеризовать достаточно быстро с помощью молекулярных методов в отношении числа вставок (КПЦР), сайт инсерции (splinkerette ПЦР), идентичность нарушенного гена (BLAST), и его уровень экспрессии ( RT-КПЦР). Вставка РВ может быть remobilized по временной экспрессии MPB транспозазы в клоне, чтобы восстановить последовательность ДНК дикого типа и, таким образом проверить за потерю стрессоустойчивости. Эти мощные способы, чтобы подтвердить причинно-следственную связь мутации, которые должны быть сделаны додорогим производства мыши. Предыдущие исследования показали, что клетки подвергаются стресс-утратили плюрипотентности 4,5. Таким образом, в этом протоколе, сохранение набора реплик мутантных клеток, которые не будут обращаться с стресса является критическим для успешного производства мыши.

Наша лаборатория инженерии линии клеток C9 ES и вектор ПБ-УПА, и доступны для других исследователей по запросу. Протокол сообщил здесь начнется генерацией De Novo библиотеки генов-ловушке ЭС клеток с PB-УПА (рис 1А), с последующим реплик и выбор напряжения для изоляции стресс устойчивых клонов (Рис 1b). Мы показали, выделение параквату, мощного генератора свободных радикалов внутри клетки. Практически любая цитотоксического соединения или токсин, например, ER стресс-(например, тапсигаргин и туникамицина), нейронная окислителем (например, МРР +, 6-гидрокси допамина и ротенон), тепло, и тяжелаяметаллы (например, Cd, Se), могут быть адаптированы к способу для отбора соответствующих устойчивых мутантов.

Protocol

1. Джин-ловушке ES сотовый Библиотека Строительство Использование PiggyBac транспозонов Подготовка первичных эмбриональных фибробластов мыши (ПМЭФ) в качестве питателей для ES культуре клеток Разморозить один флакон митомицин С инактивированной ПМЭФ (5,0 х 10 6) в водяной…

Representative Results

В типичном эксперименте мутагенеза, трансфекции состоит из в общей сложности 3 х 10 7 ЭС клеток PB-УПА и МПБ транспозазы. Числа гена-ловушке ЭС клеток, полученных в двух независимых экспериментов суммированы в таблице 1. Эффективность генной захвата составляет около 0,04%. Объ?…

Discussion

Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).

Materials

Vector
PB-UPA
mPBase
mPBasePuro
Tissue Culture 
500-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU05RE
250-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU02RE
50-ml Steriflip-GV filters EMD Millipore SE1M179M6
KO DMEM Life Technologies 10829-018
DMEM Sigma-Aldrich D6429
FBS Tissue Culture Biologicals 104
Heat Inactivated FBS Sigma-Aldrich F4135-500
LIF EMD Millipore ESG1107
Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Pen/Strep Life Technologies 15140148
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Methyl Viologen dichloride (Paraquat) Sigma-Aldrich 856177
Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX Sigma-Aldrich D2650
EmbryoMAX 0.1% gelatin EMD Millipore ES006B
DPBS/Modified HyClone SH30028.02
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
T25 Flask Corning 353108
T75 flask Corning 353135
100-mm  plate Corning 353003
150-mm  plate Corning 430599
96-well  plate Corning 3585
96-well U-bottom plate Corning 3799
24-well plate Corning 3526
50-ml reservoir  Corning 4870
15-ml tubes VWR International, LLC 82050-276
Primary Mouse Embryonic Fibroblasts EMD Millipore PMEF-NL
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts Applied StemCell ASF-1001
Mitomycin C Fisher BioReagents  BP25312
Geneticin (G418) Life Technologies 11811-023
Doxycycline Fisher BioReagents  BP26531
Cryotubes Thermo Scientific 377267
Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5702
TC10 cell counter Bio-Rad
Counting Slides (for TC10) Bio-Rad 1450011
Electroporation 
Gene Pulser Xcell Bio-Rad 1652611
Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) Bio-Rad 1652088
Molecular Biology 
Thermal Cycler Eppendorf Mastercylcer ep Gradient  S
Puregene Core kit B Qiagen 158745
Topo-TA Cloning kit Life Technologies  450030
High Capacity cDNA synthesis kit Applied Biosystems 4368814
NaCl Fisher BioReagents  BP358-212
100% ethanol Decon Laboratories, Inc. 2716
Double Processed Tissue Culture Water Sigma-Aldrich W3500
Sau3A1 New England BioLabs R0169L
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202T
EcoRV New England BioLabs R3195S
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992)
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Hydrochloric Acid Fisher BioReagents  A144-212
EDTA Sigma-Aldrich E5134
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L5777
Proteinase-K Fisher BioReagents  BP1700
Electrophoresis
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad 170-4469EDU
LE Agarose  GeneMate E3120500
Ethidium Bromide  Fisher BioReagents  BP1302
100 BP DNA Ladder New England BioLabs N3231S
1Kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S
2-log DNA Ladder New England BioLabs N3200L

References

  1. Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
  2. Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
  3. Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
  4. Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
  5. Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
  6. Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
  7. Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
  8. Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
  9. Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
  10. Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
  11. Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
  12. Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
  13. Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
  14. Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).

Play Video

Cite This Article
Ludwig, M., Kitzenberg, D., Chick, W. S. Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice — A High-throughput Screen in ES Cells. J. Vis. Exp. (105), e53062, doi:10.3791/53062 (2015).

View Video