ES細胞におけるハイスループットスクリーニングを - マウスにおけるストレス抵抗性遺伝子を明らかにフォワード遺伝的アプローチ

長寿はストレス耐性との親密な関係を持っています。一般的には、長寿命の種は、多くの場合、過酸化水素、パラコート（PQ）、UV、熱、及び重金属^1,2のような複数のストレスに向かって抵抗が増大し実証します。対照的に、ストレスに対する感受性の増大を短縮寿命および/または複数の疾患を起こしやすい表現型を予測する傾向があります。抗酸化掃気経路は長く、動物にストレス耐性を付与するに主要な役割を果たしていると推測されています。しかし、いくつかの例外を除いて、様々な抗酸化酵素 （例えば、SOD）での操作とトランスジェニック動物の多様からの研究では、酸化剤捕捉酵素のレベルを増加させると、寿命や健康スパン^{3を増加させない}ことを示しています。これらのデータは、一貫して長寿命の動物で観察されたストレス耐性形質がまだ発見される他の細胞経路によって媒介されることを示唆しています。

我々は公平な前進を取りました上に変異遺伝子を同定するための遺伝学的アプローチは、培養された胚性幹（ES）細胞におけるストレス耐性表現型を付与することができました。 ES細胞は、この研究において二つの大きな利点を提供する：（1）高度な遺伝子操作は、ES細胞のゲノムを改変するために利用可能です。 （2）画面から回収ストレス耐性ES細胞を直接全動物試験への急速な変換が寿命及び健康スパンを測定することができ、マウスの製造に使用することができます。

本稿では、BLMの対立遺伝子が、テトラサイクリン応答性エレメントの制御下にあったここでC9のES細胞株の使用を説明しました。ドキシサイクリン（DOX）の治療は、一時的に姉妹染色分体交換の増加事件につながるBLMの発現をオフになっています。この短期BLMノックアウトストレス耐性の劣性突然変異はスクリーニングプロセスで捕捉できるようにヘテロ集団内のホモ接合変異を生成するために許可されています。我々また、ランダムにゲノム中の遺伝子を変異させるポリトラップカセット（PB-UPA）を挿入するための変異原としてのpiggyBac（PB）、トランスポゾンの使用を記載しています。ポリトラップによる遺伝子の破壊を有する細胞はG418耐性となり、遺伝子トラップ変異体（遺伝子トラップライブラリー）の収集が行われ、その後、ストレス耐性た変異体クローンについてスクリーニングすることができるように回収することができました。

選択から回収したストレス耐性クローンは、挿入の数（定量PCR）の点で、分子技術によってかなり迅速に特徴付けることができ、挿入部位（splinkerette PCR）、破壊された遺伝子（BLAST）の正体、およびその発現レベル（ RT-qPCRを）。 PBの挿入は、野生型DNA配列を復元するため、ストレス耐性の損失をテストするために、クローンでMPBトランスポザーゼの一過性発現によってremobilizedすることができます。これらは、前に行われるべきである変異の因果関係を確認する強力な方法であります高価なマウスの生産に。以前の研究では、ストレッサーにさらされた細胞は、その多能性^{4,5を失った}ことを示しました。したがって、このプロトコルでは、ストレス因子で処理されない変異体細胞の複製セットの保存が成功したマウスの生産のために重要です。

私たちの研究室では、両方が要求に応じて他の研究者に利用可能であり、C9 ES細胞株およびPB-UPAベクトルを開発しました。プロトコルは、ここで報告されたストレス耐性クローン（ 図1B）を分離するためにレプリカプレーティング、ストレスの選択に続いて、PB-UPA（ 図1A）との遺伝子トラップされたES細胞のデノボライブラリーの生成によって開始されます。我々はパラコート、細胞内で強力なラジカル発生剤を用いた選択性を示しました。事実上、任意の細胞毒性化合物または毒素、例えば、ERのストレス要因（例えば、タプシガルギンおよびツニカマイシン）、神経細胞の酸化剤（例えば、MPP +、6-ヒドロキシドーパミン、およびロテノン）、熱、および重いです金属（ 例えば、CD、SE）は、それぞれの耐性変異株を選択するための方法に適合させることができます。