Forward Genetische Aanpak stress resistentiegenen in Muizen Ontdek - Een High-throughput scherm in ES-cellen
Summary
Stressbestendigheid is een van de kenmerken voor een lange levensduur en is bekend genetisch geregeld. Hier, een onbevooroordeelde high-throughput methode ontwikkelden we voor het screenen op mutaties die stress-resistentie in ES-cellen waarmee de muis modellen te ontwikkelen voor een lange levensduur studies.
Abstract
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Introduction
Levensduur heeft een intieme relatie met stressbestendigheid. In het algemeen, langlevende soorten vaak aantonen verhoogde weerstand tegen meerdere stressoren, zoals waterstofperoxide, paraquat (PQ), UV, hitte en zware metalen 1,2. Daarentegen verhoogde stressgevoeligheid neigt kortere levensduur en / of een ziekte-gevoelig fenotype voorspellen. De anti-oxidant scavenging route is lang gespeculeerd een belangrijke rol spelen bij het verlenen van stressresistentie aan het dier. Echter, met weinig uitzonderingen, studies van verschillende transgene dieren manipulaties in diverse anti-oxidant enzymen (bijvoorbeeld SOD) geven aan dat het verhogen van het oxidatiemiddel scavenging enzymen niet verhoogt levensduur of de gezondheid overspanning 3. Deze gegevens suggereren dat de stressresistentie eigenschap consistent waargenomen in langlevende dieren wordt gemedieerd door andere cellulaire routes nog worden blootgesteld aan.
We namen een onbevooroordeelde vooruitgenetische benadering genen die bij gemuteerd, kan een stress-resistentie fenotype in gekweekte embryonale stamcellen (ES) cellen verlenen identificeren. ES-cellen bieden twee belangrijke voordelen in deze studie: (1) verfijnde genetische manipulaties zijn voor het genoom van de ES-cellen te wijzigen; en (2) stress resistente ES-cellen gewonnen uit het scherm kan direct worden gebruikt voor muizen produktie, waardoor een snelle vertaling in geheel dierproeven levensduur en gezondheid overspanning meten.
In dit rapport beschrijven we het gebruik van C9 ES cellijn, waarbij de Blm allelen werden onder controle van een tetracycline responsieve element. Behandeling van doxycycline (DOX) kortstondig uitgeschakeld de uitdrukking van Blm leidt tot verhoogde incident van zusterchromatide uitwisseling. Deze korte-termijn Blm knock-out termijn voor het genereren van homozygote mutaties in de populatie heterozygote zodat recessieve mutaties voor stressbestendigheid kan worden meegenomen in de screening. Weook beschreven het gebruik van piggyBac (PB) transposon als mutageen willekeurig invoegen poly-A trap cassette (PB-UPA) te muteren genen in het genoom. Cellen met verstoring van een gen door de poly-A val werd G418 resistente en kon worden hersteld, zodat een verzameling van gen-trap mutanten (gen-trap bibliotheek) zou kunnen worden gemaakt, en vervolgens gescreend op mutante klonen die stressbestendig zijn.
Stress resistente klonen gewonnen uit de selectie kan vrij snel worden gekarakteriseerd door moleculaire technieken ten aanzien van het aantal inserties (qPCR), de plaats van invoeging (splinkerette PCR), de identiteit van het verstoorde gen (BLAST) en het expressieniveau ( RT-qPCR). De PB insertie kan remobilized door transiënte expressie van MPB transposase in de kloon met het wild-type DNA-sequentie te herstellen en aldus testen voor het verlies van stressresistentie. Dit zijn krachtige manieren om causaliteit van de mutatie te bevestigen dat vooraf moet worden gedaandure muis productie. Eerdere studies toonden aan dat cellen blootgesteld aan stressoren verloren hun pluripotentie 4,5. Dus, in dit protocol, het behoud van een replica set van gemuteerde cellen, die niet zou worden behandeld met stressoren is van cruciaal belang voor een succesvolle muis productie.
Ons laboratorium heeft de C9 ES-cellijn en de PB-UPA vector ontworpen, beide zijn beschikbaar voor andere onderzoekers op verzoek. Het protocol hier gerapporteerde start door het genereren van de novo bibliotheek van gen-gevangen ES-cellen met PB-UPA (figuur 1A), gevolgd door replica plating en stress selectie stress resistente klonen (figuur 1B) te isoleren. We toonden de selectie met paraquat, een krachtige vrije radicalen generator in de cellen. Vrijwel elke cytotoxische verbinding of toxine, bijvoorbeeld ER stressoren (bijvoorbeeld thapsigargin en tunicamycine), neuronale oxidant (bijv MPP +, 6-hydroxy dopamine en rotenon), hitte en zwaremetalen (bijvoorbeeld Cd, Se), kunnen worden aangepast om de werkwijze te selecteren voor respectieve resistente mutanten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Materials
| Vector | ||
| PB-UPA | ||
| mPBase | ||
| mPBasePuro | ||
| Tissue Culture | ||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
| T25 Flask | Corning | 353108 |
| T75 flask | Corning | 353135 |
| 100-mm plate | Corning | 353003 |
| 150-mm plate | Corning | 430599 |
| 96-well plate | Corning | 3585 |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
| 24-well plate | Corning | 3526 |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | |
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
| Electroporation | ||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
| Molecular Biology | ||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
| Electrophoresis | ||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
| 1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |
References
- Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
- Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
- Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
- Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
- Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
- Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
- Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
- Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
- Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
- Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
- Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
- Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
- Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).
