JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
English

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Dalbavancin에 대한 참조 국물 Microdilution 방법<em> 체외</em호기성 박테리아의 성장> 감수성 테스트

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53028
, ,
1Laboratory Specialists, Inc, 2Clinical Microbiology, Actavis plc

Summary

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Abstract

항균제 감수성 검사 (AST)는 각종 세균에 대한 항균제의 체외 활동을 평가하기 위해 수행된다. 최소 억제 농도 (MIC를)로 표현되는 AST 결과는, 저항 개발의 항균 개발 및 모니터링을위한 연구 및 항균 치료 지침은 임상에서 사용된다. Dalbavancin은 그람 양성균에 의한 급성 세균성 피부 및 피부 구조의 감염의 치료를 위해 식품 의약품 안전청 (FDA)에 의해 승인 2014년 5월 된 반합성 lipoglycopeptide 항균제이다. 현재 항 포도상 구균 치료를 통해 dalbavancin의 장점은 1 회 투약을 허용 긴 반감기입니다. Dalbavancin는 응고 효소 음성 포도 구균 (모두 메티 실린 감수성 황색 포도상 구균 [MSSA]과 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 [MRSA] 포함) 황색 포도상 구균에 대한 활성을 <em> 폐렴 구균, 연쇄상 구균 anginosus 그룹, β – 용혈성 연쇄 구균과 반코마이신 감수성 장구균. 플라스틱에 대한 약제의 부착을 경감 할 원액 및 폴리 소르 베이트 80 (P80)를 준비 할 때, 다른 최근 lipoglycopeptide 제, CLSI 및 ISO 브로스 감수성 시험 방법의 최적화 유사한 용매로서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 사용을 포함한다. 임상 연구 및 dalbavancin 초기 개발 단계에 앞서, 감수성 시험은 P-80를 이용하여 수행하고 MIC의 결과는 2-4 배 이상, 마찬가지로 높은 MIC 결과 한천 희석 감수성 방법으로 얻었다 경향되지 않았다. Dalbavancin 먼저 2005 년 CLSI 국물 microdilution 방법 테이블에 포함 DMSO 및 P-80의 사용을 명확히 2006 년에 개정 하였다. 국물 microdilution 여기에 표시 (BMD) 절차는 dalbavancin에 고유 및 단계별 세부 사항 및 FOC로, CLSI 및 ISO 방법에 따라입니다중요한 단계에 우리는 명확하게했다.

Introduction

Dalbavancin 그람 양성균 1에 의한 급성 세균성 피부 및 피부 구조의 감염을 치료하기위한 2014년 5월 FDA에 의해 승인 된 반합성 lipoglycopeptide이다. 비디오 포맷이 방법을 자세히 설명의 주 목적은 정확하고 재현성 dalbavancin 감수성 시험 및 결과의보고를위한 임상 실험 및 연구 과학자에게 명확한 지침을 제공하는 것이다.

상업적인 방법으로 항균제의 MIC 결정 일상적 병원성 세균에 대한 에이전트의 시험 관내 활성의 평가를 위해 임상 실험실에서 수행된다. CLSI 및 ISO 2,3,4- 권장 여기 기재된 방법은 액체 배지 희석법이다. 디스크 확산과 한천 희석법 (이 출판 당시) 상업 감수성 방법은 사용할 수 없습니다 dalbavancin 때문에 현재 F를하지 않는 것이 좋습니다또는 dalbavancin, 참조 국물 희석 방법 12, 14 사용할 수있는 현재의 옵션이 있습니다. 이 참조 방법은 상용하지 않고 FDA는 실험실 개발 테스트 (LDT)에 대한 규제 요구 사항을 준수해야합니다 환자 테스트를 위해이 절차를 사용하여 미국에서 체외 진단 방법, 임상 실험실을 지워있다. 그것은 dalbavancin 사용이 증가함에 따라, 더 많은 실험실이 화합물을 시험 할 필요가있는 것으로 예상된다. S의 dalbavancin 민감도의 결정에 대한 대리로 반코마이신 테스트 구균은 5 검증되었습니다. 그러나, dalbavancin는 반코마이신 중간 S.에 활성화 될 수 구균 (VISA) 따라서는 임상 dalbavancin 마이크 결과를 요청할 수있다. 또한, 다른 박테리아 종에 대한 MIC 결과는 요청 할 수있다.

S.에 대한 dalbavancin에 대한 FDA의 취약 중단 구균은 ≤0.12 μg의 / ㎖에서 설립되었습니다. FDA 할당 만 suscepti때문에 내성 균주에 대한 자료의 부족의 상상력 범주. 야생 유형 S. 중 정상 MIC 배포 구균 분리는 0.06 μg의 / ㎖의 명확한 모달 마이크 μg의 0.03-0.12 사이 / ㎖이다. 인해있어서 차이에 MIC 결과에 약간의 변동은, ± 하나 희석 고유 BMD 변화 이외에, 잠재적 감수성 속도에 상당한 영향을 미칠 수있다. 다른 lipoglycopeptide 에이전트 마찬가지로 6, dalbavancin 감수성 시험 결과 어려울 수 용해도 및 분자의 비교적 큰 크기와의 결합 특성 7,8,9. 여기에 설명 된 기준 BMD 방법은 불용 화제 및 / 또는 lipoglycopeptide 에이전트 고유 두 특정한 단계를 포함한다 : (1) 최종 MIC 패널의 스톡 용액의 준비 및 0.002 % P-80 (2) 첨가 용 DMSO 이용 희석. 이 동영상 게시의 목적은 dalbavancin BMD 방법 및 사양보다에 선명도를 제공하는 것입니다에서야 정확하고 재현성있는 MIC 결과를 보장하기 위해, 다음과 같은 주요 단계에 초점을 맞 춥니 다.

Protocol

항균제 감수성 2, 3, 4에 대한 기준 배지 희석법의 전체 내용은 CLSI 문서 M7-A10과 M100-S25 및 / 또는 ISO / FDIS 20776-1 참조 참조 방법이 몇 가지의 옵션을 허용 : 참고. 접종 준비 및 MIC 패널 생산에 특정 절차는 동일한 최종 결과가 달성했다. 여기에 설명 된 방법은 하나의 항균제, dalbavancin에 관한 것으로, 일부 단계는 기준 절차를 수행 할 수있는 잠재적으로 여러 가지 방법 중 하나를 대표한다. (바이오 안전성 레벨 2와 일치) 적절한 안전주의 사항은 (10)를 이용해야한다. 이 비디오 공개의 목적을 위해 사용 MIC 패널 형식은 표 1에 나타낸다. 1. 스토어 Dalbavancin 파우더 비 제상 냉동 건조 된 환경에서 -20 ℃로 진단 급 dalbavancin 분말 저장소의 수신시. 사용하기 전에, 분말로 평형화되어야열기 전에 실온에 도달합니다. 2. MIC 패널 희석 준비 멸균 유리 또는 플라스틱 튜브의 깔끔한 (순수) DMSO에 dalbavancin의 더 높은 1,600 ㎍ / ㎖의 원액을 준비하지 않고, -60 O를 C 또는 아래에 나중에 사용하기 위해 -20에서 준비 또는 저장소의 같은 날에 사용 비 냉동 해동. 분말을 계량 할 때 분말로받은 문서에 규정 된 바와 같이 고려 dalbavancin의 힘을 가지고 (예 : 800 μg의 / ㎖ 재고 준비를 위해 수학 식 1 참조). 멸균 유리 또는 플라스틱 튜브에 깔끔한 DMSO와 표 2에 1 열 ( "소스 농도")에 도시 한 바와 같이 제도와 유사한 주식 희석 희석. 희석제 및 제 1 튜브에 초기 dalbavancin 주식을 추가하기위한 또 다른 피펫을 측정 한 피펫을 사용합니다. 각각의 후속 dalbavancin 스톡 농도에 대한 새로운 피펫을 사용합니다. 100X 최종 MIC 패널 승낙을 준비깔끔한 DMSO와 배급 희석 (중간 농도). 열 (2)의 표 2-4에 나타낸 바와 같이, (만들어 질 MIC 패널의 수에 의존 할 것이다 사용될 볼륨) 원하는 중간 농도를 달성하기 위해 소스 및 DMSO의 적절한 양을 결합한다. 0.004 %의 P80을 준비 : 4.9 ml의 DH 2 O 0.1 ML의 P80을 추가하여 2 % P80의 신선한 작업 주식 솔루션을 준비 제조 당일에 0.22 미크론 필터를 사용하여 용액을 통과하는 살균. (CAMHB의 149.7 ml의 예를 들면, 0.3 ml의 2 %의 P80) 500 희석 2 %의 P80 : 1을 만들어 0.004 %의 P80의 희석제를 준비합니다. 또한 단계 2.2 1에서 제조 한 중간 농도를 희석 : 100을 0.004 %로 보충 양이온 조정 된 뮐러 힌튼 브로스 (CAMHB)에 (V는 / V) 폴리 소르 베이트 80 (P는-80) P-80 및 / 또는 LHB (구균 용)를 첨가 2 희석 : 이중 최종 농도로 접종한다 (단계 4.3)를 첨가 한 결과 때문이다. 표 2 열 6, 7 참조 </st> 룽. 3. MIC 패널을 준비 MIC 패널의 적절한 우물에 단계 2.3에서 제조 된 각각의 dalbavancin 솔루션의 50 μl를 분배하고 (물론 성장 제어) 하나의 잘 미디어를 포함한다. 멸균 팁 멀티 채널 피펫이 단계에 사용될 수있다. 즉시 패널을 사용하거나 비닐 봉투 플라스틱 필름, 장소 밀봉 즉시 ≤-20 O C (바람직 ≤-60 O C에서) 필요할 때까지에서 비 서리 제거 냉동실에 넣습니다. 고정 패널을 사용하는 경우, 씰을 제거하고 (물론 내용이 해동 될 때까지) 패널 접종을 진행하기 전에 15 ~ 30 분 동안 실험실 벤치에 개별 패널을 배치합니다. 4. 마이크 패널의 예방 순도 및 설치 식민지 카운트를 수행 18 ~ 24 시간의 피 한천 또는 다른 비 선택적 한천 판에서 몇 가지 잘 격리 식민지를 선택합니다. 1-5 ML의 CAMHB 또는 S에 멸균 루프 또는 면봉 및 전송 각 식민지의 상단을 터치탁도까지 알린는 0.5 맥팔랜드 표준에 해당합니다. 0.5 맥팔랜드 또는 광도 장치와 시각적으로 비교하여 탁도를 평가합니다. CAMHB에서 1​​00 (100 μL 10 ㎖의 CAMHB에) : 준비 15 ~ 30 분 이내에, 접종 1을 희석. S. 제외한 dalbavancin 대해 테스트 대부분 세균에 대한 폐렴이 희석액 5 × 105 CFU / ㎖의 최종 농도가 웰 (허용 범위는 2-8 × 105 CFU / ㎖이다)을 제공한다. S. 들어 폐렴, 0.5 맥팔랜드에 탁도의 비교에 기초하여 세균 농도 따라서, (10 ㎖ CAMHB + 10 % + LHB으로 400 μL)를 접종 1:25 희석 상당히 덜 일반적이다. 균액의 조제 후 15 분 이내에 멸균 팁을 사용하여 멀티 채널 피펫이 단계에 사용할 수있는 3 단계에서 제조 MIC 패널 (멸균 제어 제외한 웰으로)를 각 웰에 최종 접종의 50 μl를 옮긴다. 순도 검사를 수행전송 잘 비 선택적 한천 (5 % 양 혈액 예를 들어, 트립 티카 콩 한천)에 멸균 루프를 사용하여 긍정적 인 성장 컨트롤에서 1-10 μL 나누어지는을 뿌려. (1,000 희석 1) 생리 식염수 10 ml의 성장 제어도 단일 채널 피펫 및 무균 팁과 전송에서 10 μl를 제거하여 설치 식민지의 수입니다. 다른 방향으로 두 번 믹스 적합한, 비 선택적 한천 배지 (예를 들어, 트립 티카 간장 5 % 양 혈액 한천) 및 멸균 루프 전체 한천 표면에 걸쳐 반복 단일 채널 피펫과 멸균 팁 100 μl를 전송 접종 (1시 10분 희석)의 고른 분포를 보장합니다. 5. 품어 마이크 패널, 식민지 개수 및 순도 플레​​이트 플라스틱 테이프 또는 배양 전에 꽉 끼는 플라스틱 커버, 비닐 봉지에는 4 개 이상의 패널의 각 MIC 패널 또는 스택을 밀봉합니다. 또한, T에 빈 마이크 패널을 배치이하 4 MIC 패널 스택의 영업 이익, 플라스틱 용기 젖은 종이 타월을 배치, 플라스틱 용기 안전하게 뚜껑 닫기 용기에 장소 마이크 패널. 16 ~ 20 시간 (포도상 구균과 장구균) 및 접종 후 30 분 이내에 20 ~ 24 시간 (연쇄상 구균) 35 ° C ± 2 ° C에서 대기 인큐베이터에서 MIC 패널을 품어. 을 5 % CO 2 배양기에서 품어 구균 제외하고 동일한 조건에서 식민지의 수와 순도 번호판을 품어. 6. 마이크를 읽고 식민지 플레이트 카운트; 순도 플레​​이트를 확인 완전히 육안으로 감지로 우물에서 세균의 성장을 억제 낮은 농도 MIC를 읽어보십시오. 식민지 카운트 접시에 식민지를 계산합니다. 희석 배수 (1 : 10,000)에 의해 각각의 식민지를 곱하면 (예를 들면, 50 식민지는 5 × 10 5 CFU / ㎖에 해당). 허용 범위는 20 ~ 80의 식민지입니다 (2-8 × 10 5 CFU / ㎖)과 아프로로 사용된다ximate 가이드 라인. 순도 판을 확인하십시오. 모든 콜로니는 단계 4.1에서 사용 된 콜로니과 유사한 경​​우, 접종 물은 순수한 것으로 간주 될 수있다. 본 다른 콜로니가있는 경우 오염물 MIC 패널에 존재하는 것으로하고, 시험이 반복되어야 들면 다음 가능성이있다. 7. 품질 제어 결과. CLSI 품질 관리 균주의 예상 범위는 표 3을 참조하십시오. 만 품질 관리 유기체 (들)에 대한 dalbavancin MIC 결과가 예상 범위 내에있는 균주하는 경우 테스트의 결과를보고한다. μg의 ≥0.25 / ㎖의 MIC는 임상 S. 위해 얻어지면 구균은 dalbavancin 마이크 테스트를 반복 및 / 또는 검증을위한 기준 실험실로 보내 격리.

Representative Results

표준화 MIC 방법 저항 개발 다양한 항균 감시 프로그램의 중요한 목표를 모니터링하기 위해 필요하다. 2011에서 2013 사이에 유럽과 미국에서 수집 된 균주에 대한 Dalbavancin MIC 결과 S.aureus의 99.9 %와 연쇄상 구균의 100 % (도표 4)에 대한 <0.25 ㎍ / mL로했다. 신선한 (밀봉) DMSO, 품질 관리 균주 S. 대한 dalbavancin의 골밀도 MIC를 세중 테스트를 사용의 중요성을 평가하기 위해 구균 ATCC 29213,와 E 및 ATCC 29212 패 칼리스 (S)에 대한 테스트를 중복 폐렴 ATCC 49,619는 유효 기간 이내, 2 세를 위해 이전에 사용 된 1 L 병에서 밀봉 앰플로부터 (1) DMSO (2) DMSO를 사용하여 수행 하였다 (3)과 동일한 1 L에서 DMSO의 분취 사용하기 전에 72 시간 동안 열린 비이커에 방치 된 병 (샘플 2). 세 DMSO 샘플로 만든 패널을 사용 Dalbavancin 마이크 결과는 유사한 승했다허용 가능한 범위를 ithin QC (표 5). P-80의 첨가없이 플라스틱 및 원액의 노출 다음 dalbavancin 활성의 손실은 7 잘 문서화되고있다. 2 개의 추가 연구 초기 및 중간 스톡 솔루션 (표 6)에 P-80을 첨가하고, 초기 및 중간 스톡 용액의 제조를위한, 유리 또는 플라스틱 튜브의 사용 (표 7)에 영향을 미치지 않았다 dalbavancin 마이크 결과. 세 제조 업체의 폴리 프로필렌, 폴리스티렌 플레이트 (표 7)를 사용했을 때 dalbavancin MIC 결과에 아무런 영향도 없었다. 구균의 테스트 브로스 배지에서 용해 말 혈액의 존재는 P-80 (7), (8)에 필적 활성제 – 유사 활성을 갖는 것이 밝혀졌다. 스트렙토위한 dalbavancin 참조 방법은 모두 P-80 및 용해 말 혈액을 포함 않는다 ,그러나, 포도상 구균과 장구균과는 달리, 연쇄상 구균에 대한 dalbavancin 마이크 결과와 P-80의 추가없이 (+ 1 희석 이내)과 유사하다. 이전에 제시되고도 1에 도시 한 바와 같이, dalbavancin 한천 희석 (AD) MIC는 2-8 배 더 높은 전류 BMD 기준 12, 13, 14에 비해. BMD, 0.002 %의 첨가는 달리 P-80 그렇지 않은 전형적 MIC 12 결과 dalbavancin AD에 영향을 미칩니다. 수학 식 1 :. 800 μg의 / ㎖ dalbavancin 용액 25ml를위한 Dalbavancin 원액 제조 준비 단계의 예. 광고에 Dalbavancin과 반코마이신 골밀도 그림 1. 비교. dalbava 비교 연구 결과ncin과 반코마이신 골밀도를 선택 그람 양성 박테리아 균주에 대한 광고 MIC 결과. 평균 (A) Dalbavancin 및 (B) (15) 황색 포도상 구균, 8 포도상 구균 (Coagulase negative staphylococi) (CNS), (5) 엔테로 코커스 패 칼리스 14 연쇄 구균에 대한 μg의 / ㎖ 반코마이신 국물 Microdilution 한천 희석 MIC 결과 (그룹 A, B 및 C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 1 (2) 3 4 (5) (6) 7 8 9 (10) (11) (12) DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 달 0.03 DAL; 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL (1) DAL 2 순위 Ctrl 키. (B) DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 달 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL (1) DAL 2 순위 Ctrl 키. C DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 달 0.03 DAL 0.06 DAL0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL (1) DAL 2 순위 Ctrl 키. 디 DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 달 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL (1) DAL 2 순위 Ctrl 키. E DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 달 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 </TD> DAL 0.5 DAL (1) DAL 2 순위 Ctrl 키. F DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 달 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL (1) DAL 2 순위 Ctrl 키. G DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 달 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 00.5 DAL (1) DAL 2 순위 Ctrl 키. H DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 달 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL (1) DAL 2 순위 Ctrl 키. DAL Dalbavancin <td> 농도는 50 μL / 웰 접종 후 μg의 / ㎖에 명시되어 표 1. 마이크 플레이트 형식.이 비디오 책에서 예제로 사용 dalbavancin 희석 및 양성 대조군 웰의 96 웰 플레이트 형식으로 보여주는 위치 1 (2) 3 4 (5) (6) 7 8 소스에 농축. (μg의 / ㎖) 볼륨 소스 (㎖) 볼륨 DMSO (㎖) 중간에 농축. DMSO에 (μg의 / ㎖) 볼륨 중간에 농축. (㎖) 볼륨 CAMHB + 0.004 %의 P80의 * (㎖) 배에 농축. 1 후 : CAMHB 100 희석 (μg의 / ㎖) 최종 패널이 용액에 농축. 포스트 접종 (μg의 / ㎖) (800) 1.0 1.0 (400) 0.02 1.98 4 (2) (400) 0.5 0.5 (200) 0.02 1.98 (2) 1 (400) 0.5 1.5 (100) 0.02 1.98 1 0.5 (400) 0.5 3.5 (50) 0.02 1.98 0.5 0.25 (50) 0.5 0.5 (25) 0.02 1.98 0.25 0.125 (50) 0.5 1.5 12.5 0.02 1.98 0.125 0.06 (50) 0.5 3.5 6.25 0.02 1.98 0.06 0.03 6.25 0.5 </ TD> 0.5 3.13 0.02 1.98 0.03 0.015 6.25 0.5 1.5 1.5 0.02 1.98 0.015 0.008 6.25 0.5 3.5 0.8 0.02 1.98 0.008 0.004 0.8 0.5 0.5 0.4 0.02 1.98 0.004 0.002 이 테이블은 CLSI M100-S25, 표 8B 3에서 수정되었습니다 불용성 항균제의 희석을 준비 표 2. 방식은 국물 희석 감수성 시험에 사용한다. dalbavancin 작업 솔루션 및 희석제의 볼륨을 최종 MIC의 준비0.002-2 μg의 / ㎖의 dalbavancin 솔루션을 제공합니다. 품질 관리 스트레인 예상 Dalbavancin MIC (μg의 / ㎖) 황색 포도상 구균 ATCC 29213 0.03-0.12 E. 칼리스 ATCC 29212 0.03-0.12 폐렴 구균 ATCC 49619 0.008-0.03 제안 된 품질 관리 용 균주 균주 3, 11. CLSI 품질 관리 결과를 표 3 예상 Dalbavancin MIC 결과는 적절한 방법을 확인하기 위해 임상 분리와 함께 테스트 될 미국과 유럽 2011에서 2013 사이 Surveill에서 (각 MIC에서 번호) Dalbavancin MIC 결과 표 4. 유통ANCE 연구 15. 생체 외 활동의 현재 dalbavancin의 지표로 최근 임상 분리의 게시 된 연구 Dalbavancin MIC 결과. #을 분리 Dalbavancin MIC (μg의 / ㎖) DMSO 1 DMSO 2 DMSO 3 황색 포도상 구균 ATCC 29213 0.12 0.06 0.06 0.12 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 E. 칼리스 ATCC 29212 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 <em> S. 폐렴 ATCC 49619 0.015 0.015 0.015 0.03 0.015 0.015 DMSO 1 = 개봉 불꽃 10 ML의 앰플을 밀봉 DMSO 2 = 자주 열어 1L 병 DMSO 3 = 자주 열어 1L 병 – 72 시간 동안 노출 된 비커에 벤치에 앉아 있었다 표 5. Dalbavancin MIC 결과 3 소스에서 DMSO와 DMSO 주식 및 중급 희석 준비를 사용하여 (μg의 / ㎖). dalbavancin 재고 및 중간 희석의 준비에 다른 DMSO 용매를 사용하여 효과를 비교 dalbavancin 마이크 연구 결과. 수 분리 번호를 복제 Dalbavancin MIC (μg의 / ㎖) DMSO의 DALB 승​​ / P80 DALB 승​​ DMSO에 O P80 / 황색 포도상 구균 ATCC 29213 1 0.06 0.06 (2) 0.06 0.06 3 0.06 0.06 4 0.06 0.06 황색 포도상 구균 임상 DP80-002SA 1 0.03 0.03 황색 포도상 구균 ATCC 700699 1 0.5 0.5 폐렴 구균 ATCC 49619 1 0.03 0.015 (2) 0.03 0.015 3 0.03 0.015 4 0.03 0.015 S. pyogenes의 임상 : DP80-004PY 1 0.015 0.015 DP80-005PY 1 0.03 0.03 DP80-006PY 1 0.03 0.015 DP80-007PY 1 0.06 0.03 DP80-008PY 1 0.03 0.015 미 임상 agalactiae : DP80-009AG 1 0.06 0.12 DP80-010AG 1 0.06 0.03 DP80-011AG 1 0.06 0.06 DP80-012AG 1 0.06 0.06 S.의 dysgalactiae의 cliniCAL DP80-013DY 1 0.03 0.03 미 임상 폐렴 : DP80-014SP 1 0.06 0.06 DP80-015SP 1 0.03 0.03 DP80-016SP 1 0.03 0.03 DP80-017SP 1 0.06 0.06 와 0.002 %없이 DMSO 주식 및 중급 희석 준비를 사용하여 표 6. Dalbavancin MIC 결과 P-80. 0.002 %의 P-80은 재고 및 중간 희석 dalbavancin하는 추가의 효과를 비교 dalbavancin 마이크 연구 결과. 분리 번호를 복제 </TD> 주식 희석 튜브 마이크로 타이 터 플레이트 (플라스틱 타입) 폴리 프로필렌, 라이너 폴리스티렌 유리 플라스틱 플라스틱 1 시간 플라스틱 1 시간 / 중급 1 시간 그 라이너 코닝 NUNC 황색 포도상 구균 ATCC 29213 1 0.06 0.03 0.03 0.03 0.06 0.03 0.06 0.03 (2) 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.06 3 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 E. 칼리스 ATCC 29212 <tD> 1 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 (2) 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 3 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 폐렴 구균 ATCC 49619 1 0.015 0.015 0.015 0.015 0.008 0.008 0.008 0.008 (2) 0.015 0.015 0.015 0.015 0.008 0.015 0.008 0.008 유리 병으로 만든 유리 = 초기 재고, 중간 농도를 만들기 위해 즉시 사용즉시 사용 플라스틱 튜브에들 국물 희석을 확인합니다. 즉시 사용 플라스틱 원심 분리기 튜브에서 만든 초기 = 플라스틱 주식, 국물 희석을 즉시 사용하는 플라스틱 튜브에 중간 농도를 확인합니다. 플라스틱 원심 분리기 튜브에서 만든 플라스틱 1 시간 = 초기 주식, 다음 국물에 농도를 만들기 위해 즉시 사용 플라스틱 튜브에 중간 농도를 확인하는 데 사용 1 시간 동안 벤치에 앉아 보자. 플라스틱 원심 분리기 튜브에서 만든 플라스틱 1 시간 / 중급 1 시간 = 초기 주식, 다음, 플라스틱 튜브의 중간 농도를 확인 후 국물에 농도를 확인하는 데 사용 1 시간 동안 벤치에 앉아 있도록하는 데 1 시간 동안 벤치에 앉아 보자. 플라스틱 및 유리 튜브 및 MIC 플레이트 플라스틱 종류의 주식 희석 준비를 사용하여 표 7. Dalbavancin MIC 결과. 오 결과FA dalbavancin 또한 미세 적정 플레이트 상이한 소스 및 유형의 플라스틱을 사용하는 효과를 스톡 용액을 제조 할 때와 플라스틱 또는 유리 튜브를 사용하는 효과를 비교 MIC 연구.

Discussion

dalbavancin 마이크 테스트를 위해 준비 할 때 다음과 같은 방법 세부 사항은 추가 고려 사항에 대해 제공됩니다. 항균제의 수 (즉., dalbavancin 단독으로 또는 여러 에이전트)와 박테리아의 종 테스트 할 테스트 할에 마이크 패널의 디자인은 달라집니다. dalbavancin 농도는 적어도 하나의 QC 균주 예상 테스트 될 모든 박테리아 종과 희석액의 전체 범위에 대해 해설 중단을 포함한다. 항균 희석 시리즈는 항균제 및 / 또는 / 및 플레이트 접종 방법을 분리 개수에 따라 행 또는 열 중 하나에 구성 될 수있다. dalbavancin 분말과 액체 배지의 부피는 최적의 양이 생성되는 폐기물을 최소화하고 있는지를 확인하기 위해 계산되어야한다. 이 책에서 사용 된 예를 들어, 볼륨은 두 개의 마이크 패널의 준비를 기반으로합니다. 양이온 조정 뮬러 힌튼 국물은 사람에 따라 제조 및 멸균해야한다제조 회사의 지침과 미디어의 불임이 확인했습니다. MIC 패널을 만들어 준비 같은 날에 사용하거나 적절한 품질 관리 생물 및 향후 사용을 위해 냉동 저장된 검증 패널을 테스트 할 수 있습니다 할 수 있습니다. 이 절차에 걸쳐 무균 기술을 사용하는 것이 중요하다.

식민지 카운트 접종 농도의 확인에 대한 엄격한 기준이 없다. 식민지 카운트 단계 4.2에서 수행 희석 단계를 검증하기 위해 주기적으로 시험 및 / 또는 각 종족에 대한 초기에 확인 할 수있다. 그것은 0.5 중에 McFarland 표준의 유효성도 E. 정기적으로 점검하는 것이 중요 단계 4.5에서와 유사한 방법을 이용하여 대장균 ATCC 25922. 결과는 1-2 × 10 8 CFU에 해당하지 않는 경우 / ㎖, 새로운 0.5 맥팔랜드 표준 얻을 수 있어야합니다. MIC 우물에서 집락이 허용 범위를 벗어난 경우 (임상 분리 (들)에 대한 2-8 × 10 5 CFU가 / ㎖의 MIC 결과 일부터 다릅니다E 예상 정규 분포 (예. 0.03에서 0.12 사이는 UG / S. aureus에 대한 mL) 및 / 또는 품질 관리 분리 (들)에 대한 MIC 결과는 예상 범위 밖에있는, 검증 테스트가 필요하고있어서 변형이 보장 될 수있다. 그것은 검증 0.5 맥팔랜드 표준은 식민지 카운트 (들)을 반복 사용하는 것이 좋습니다 결과가 예상 결과의 외부 다시 경우, 단계 4.2에서 수행으로 접종 희석이 적절하게 조정해야하며, MIC 반복. 콜로니 카운트 절차가 반드시 오염 생물의 낮은 농도를 검출 할 수있다 희석 볼륨을 사용하기 때문에 콜로니 카운트가 수행되는 경우에도 순도 확인이 필요합니다.

마이크 테스트가 유효한 것으로 간주 될 경우, 허용 성장은 잘 성장 제어에서 발생합니다. dalbavancin에 대해 테스트됩니다 대부분의 세균 (예., 포도상 구균, 연쇄상 구균과 장구균은 성장 버튼 (일반적으로> 2mm) 및 이하 FR로 간주됩니다equently, 성장은 잘 탁도로 나타날 수 있습니다. 농도가 증가함에 따라 효과를 후행 나타낼 수있는 몇 가지 항균제와는 달리, dalbavancin 엔드 포인트는 일반적으로 잘 정의되어 있습니다. 한 웰의 성장을 식별 할 수있는 능력에 타협이없는 한 dalbavancin 함유 플레이트를 판독하기 위해 사용될 수있다 판독 microdilution 테스트를 용이하게하기위한 다양한 시청 장치가있다.

프로토콜 내에서 중요한 단계는 dalbavancin 및 P80의 첨가의 용해도와 관련된 절차의 부분과 관련된다. 그것은 종래 국물 희석액을 만들고 해당 DMSO를 용매로 사용하고, 중간 농도의 DMSO에서 제조되고 사용 dalbavancin의 최대 농도가 크지 1,600보다 μg의 / ㎖ 인 것이 중요되도록 MIC에서 DMSO의 최종 농도 패널 웰을 1 % 이하이다. DMSO는 흡습성이므로, DMSO 이전 병 사용 considerat이었다dalbavancin 용해도 관련하여 이온. 품질 관리 균주와 작은 골밀도의 연구는이를 보여 주었다 동안 그러나, (결과 절 참조) 중요한 변수가 될 수 없습니다, 그것은 DMSO의 신규 또는 최근에 열었던 병을 사용하는 것이 좋습니다. 그것은 P80 약물 희석 제제의 최종 단계에서 브로스에 첨가하는 것이 또한 중요하다 잘 MIC 0.002 %의 최종 농도이다.

골밀도 절차는 여기에 포함 된 잘 dalbavancin 및 P-80 농도의 두 배 최종 농도 50 μL와 접종의 추가에 / 잘 그래서 최종 부피 / 잘 100 μL이라고 50 μL /를 사용하여 마이크 패널의 준비를 이용한다. 하나 MIC 패널 형식의 모두 S. 테스트를 제조 할 수 있도록이 방법은 허용 구균과 S. 폐렴 용해 말 혈액을 접종에 첨가 될 수 있기 때문이다. 100 μL / 웰와 최대 10 μL를 첨가을 사용하여 MIC 패널의 준비를위한 다른 방법은 / 잘 설명되어 있습니다CLSI 및 ISO 절차.

S.의 dalbavancin 취약 중단 구균 ≤0.12 μg의 / ㎖ (FDA 패키지 삽입)이다. 최근 감시에 도시 된 바와 같이, 균주의 대부분은 0.06 μg의 / ㎖의 농도에서 15 dalbavancin 의해 억제된다. 가까운 모달 MIC에 민감 중단 점으로, 방법의 차이로 인해 마이크의 모든 변화는 감수성 속도에 영향을 줄 수 있습니다. dalbavancin의 골밀도 절차 (몇 가지 독특한 단계를 포함하기 때문에 특별히 잘 MIC의 재고 및 중간 약물 희석 0.002 %의 P80의 준비 DMSO의 사용은,이 방법은 정확히 다음에하는 것이 필수적이다. 황색 포도상 구균 품질 관리 유기체 0.06 ㎍ / ㎖가 매우 분명 dalbavancin 모달 마이크 (ATCC 29213), 방법 변화의 좋은 지표되었으며, 골밀도 방법을 검증하기 위해 일상적으로 사용되어야한다. MIC 결과는 0.03-0.12 μg의 예상 범위에있는 경우 / ml의,하지만 중 낮거나 HIG에 추세된다이 범위의 H 측이 방법은 더욱 유효성을 보증한다.

0.002 %의 P80의 추가는 모든 관련 그람 양성균에 대한 추천 (staphylococcci, 장내 구균 및 연쇄상 구균.) 그러나, 그것이 결합 방지의에 P-80 상대와 비슷한 역할을 말 혈액을 용해 것으로 나타났다 것을 주목할 필요가있다 능력과 + LHB가 dalbavancin 구균 MIC 결과에 추가적인 영향을주지 않습니다 CAMHB에 P-80의 추가 것을.

거기에 시험 dalbavancin 대한 디스크 확산법은 현재 없다 때문에 불량한 BMD의 상관 및 AD 결과, AD 방법을 사용 dalbavancin의 감수성 테스트 (12), (14)을 추천하지 않는다. BMD 방법은 dalbavancin 감수성의 미래 평가 표기 상업용 및 항균제 감수성 시험의 개발을위한 금 표준.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

Materials

Dalbavancin Metrics, Inc. Greenville, NC BI-397
Vancomycin Sigma-Aldrich St. Louis, MO C5793
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth Becton Dickinson Sparks, MD 212322
Lysed horse blood Cleveland Scientific Bath, OH
Dose-it peristaltic pump Integra Biosciences Hudson, NH
Multi-channel pipet (Viaflo II) Integra Hudson, NH 4164
12 channel pipet (Matrix) ThermoFisher Scientific Waltham, MA
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) VistaLab Brewster, NY
96 well microplate Greiner Bio-one Monroe, NC 650161
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
16x125mm disposable glass tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
12x17mm snap cap, polystyrene tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
16 mL centrifuge tubes BioExpress Kaysville, UT C-3394-2
Reagent reservoirs Integra Biosciences Hudson, NH 4312
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) Biologix Lenexa, KA 65-0001,65-0010
Tryptic soy agar + 5% sheep blood Becton Dickinson Sparks, MD
Incubator (ambient) Sanyo
Incubator (5% CO2) Sanyo
Analytical balance  ThermoFisher Scientific Waltham, MA
Gloves Kimberly-Clark 52817
Lab coats
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
  2. . . M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).
  3. . . M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).
  4. . Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, (2006).
  5. Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
  6. Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
  7. Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
  8. Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
  9. Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
  10. Ribbon Panel, B. l. u. e. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
  11. Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
  12. Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , (2012).
  13. Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
  14. Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
  15. Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).

Tags

Antimicrobial Susceptibility TestingDalbavancinBroth MicrodilutionCLSIISODMSOPolysorbate 80Staphylococcus AureusMRSAStreptococcusEnterococci

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. J. Vis. Exp. (103), e53028, doi:10.3791/53028 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image