JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli

Published: October 23, 2015
doi:
10.3791/52970
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Tufts University, 2Department of Pediatrics,University of Connecticut Health Center & Connecticut Children’s Medical Center

Summary

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Abstract

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Introduction

Merkezi sinir sistemi (CNS), yapısal, işlevsel, bulaşıcı veya dejeneratif damar, ilgili muhtelif rahatsızlıkların etkilenebilir. Tahminen 6,8 milyon kişinin 1 dünya çapında büyüyen bir sosyoekonomik yük temsil nörolojik bozukluklar sonucu olarak her yıl ölmektedir. Ancak, hastalıkların sadece birkaç kullanılabilir tedaviler var. Bu nedenle, nörolojik bozukluklar muzdarip hastalar için yeni terapötik stratejiler için ciddi bir ihtiyaç vardır. Ne yazık ki, pek çok CNS hedefli terapötik nedeniyle fizyolojik ilgili işlevsel okumalarla akut ve kronik etkilerinin değerlendirilmesine izin vermez yetersiz klinik öncesi araştırma modelleri, kullanımına kısmen klinik denemeler sırasında başarısız.

Geçmiş yıllarda önemli araştırma çabalarına rağmen, CNS yapısı ve fonksiyonu hakkında bilinmeyen büyük bir miktardır. Daha fazla bilgi edinmek için, hayvan modelleri sık sık bize olaned özellikle pre-klinik çalışmalarda, bu tür travmatik beyin hasarı (TBI) veya demans gibi patolojik durumları, model. Bununla birlikte, hayvanlar insan hem de merkezi sinir sisteminin anatomisinde, hem de fonksiyonu, gen ekspresyonu ve metabolizma 2-4'te önemli ölçüde farklıdır. Öte yandan, 2 boyutlu, in vitro kültürler, hücre biyolojisi araştırmak için yaygın yöntem ve rutin olarak ilaç keşfi için kullanılmıştır. Bununla birlikte, 2B hücre kültürleri karmaşıklığı ve insan beyin 5-7 ile karşılaştırıldığında fizyolojik önemi yoksundur. Düşük maliyet ve basitlik 2D hücre kültürü çalışmaları ya da hayvan modellerinde tarafından sağlanan karmaşıklığı için yerini hiçbir şey tutamaz iken, 3D doku mühendisliği vitro ve in vivo yaklaşımları 2D arasında mevcut boşluğu kapatmak için geliştirilmiş araştırma modellerini oluşturabilir. 3D doku mühendisliği 3D hücre-hücre etkileşimleri ve biyomalzeme iskelelerde tarafından sağlanan dışı ipuçları elde daha fizyolojik ilgili deneysel koşullar sağlar. Desp3D kültürlerin değeri arkasında önemli deliller ite, orada bu tür kök hücre türevli organoid kültürler 8-10 gibi birkaç 3D CNS doku modelleri, 11 neurospheroids anda ve hidrojel kültürleri 12,13 dağılmış. Çok katmanlı litografi 14, ve 3 boyutlu baskı 15 dahil olmak üzere gelişmiş teknik yöntemler akciğer, karaciğer ve böbrek dokusunu incelemek için kullanılmaktadır. Ancak, bu tür kortikal mimarisi ve biyoloji taklit olarak bölümlere nöronal büyüme için izin 3D CNS modellerin eksikliği vardır. Nöronal hücre gövdeleri nevritlerin Ayrılmış büyüme önceden akson yolu izleme, kalsiyum akını, ağ mimarisi ve faaliyetlerin çalışma izin mikroüretim 16,17 ile 2D kültürlerde ortaya konmuştur. Bu fikir hücre gövdeleri ve aksonal yolları beynin 18 katmanlı mimarisi taklit farklı bölümlerinde bulunan 3D polarize sinir dokusu geliştirmek için bize ilham </sup>. Yaklaşımımız kapalı bir hacim içindeki hücreleri göz yüksek yoğunluk uygundur ve kolajen jele yoğun aksonal ağ aşırı büyümesini sağlayan benzersiz ipek skafold tasarım kullanımına dayanmaktadır. Burada iskele imalat ve nöronal kültürü gibi beyin gibi doku tam montaj işlemini göstermektedir.

Protocol

Beyin dokusu izolasyon protokolü Tufts Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Bakımı ve Kullanımı Laboratuvar Hayvanları (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi B2011-45) Sağlık Rehberi National Institutes ile uyumludur edildi. 1. İpek İskele Hazırlık Ipek böceği kozası ipek solüsyonunun hazırlanması, daha önce 19,20 açıklandığı gibi. Makas kullanılarak 8 eşit parçaya her koza kesin. Parçalanmış koza 5 g için yaklaşık 11 koza kullanın. (15 dakika) 0.02 M Na 2 CO 3 çözeltisi 2 L hazırlayın ve sıcak bir plaka kullanılarak kaynatın getirmek. (15 dakika) Parçalanmış kozaların 5 g tartın ve 30 dakika süre ile, Na 2 CO 3 çözelti içinde kaynatın. Bir spatula ile kaynama ipek dakika her çift karıştırın. Ayrıca de-Gumming adlandırılan bu adım, hidrofil proteinler, sericins ipek fibroin arındırır. (30 dakika) <li> elle fibroin sıkın ve kalan sericin ve kimyasallar dışarı yıkamak için distile su ile en az üç kez durulayın. (5 dakika) Petri ıslak fibroin yerleştirin ve akış kaput O / N fibroin kurutun. Bir sonraki gün kuru fibroin kütle ağırlığında ve bir cam beher içinde fibroin yerleştirin. (15 dakika) 4. kuru fibroin kütlesini çarpılarak LiBr 9.3 M LiBr solüsyonu (ml) Gerekli hacmi hesaplamak içinde fibroin eritmek için yavaşça ipek fibroin üzerinde LiBr çözüm dökün ve spatula ile tüm fibroin lifleri batırmayın. Buharlaşmasını önlemek ve fiber çözünmesi için 4 saat süre ile 60 ° C 'de yerleştirmek için beher örtün. (15 dakika) Şırınga kullanarak, kaptan fibroin çözümü toplamak ve MWCO 3500 diyaliz kasetleri içine yerleştirin. 48 saat süre ile destillenmiş suya karşı diyaliz gerçekleştirin. Suya her iki saatte değiştirin. Şırınga kullanılarak, gelen Fibroin çözümü toplamak20 dakika boyunca 4 ° C'de 9000 rpm'de (12700 x g ~), iki kez 50 ml konik tüp ve santrifüj içine kasetleri. Her santrifüj aşamasından sonra yeni bir tüp içine süpernatant dökün ve pelet atın. (40 dakika) Kuru ağırlığı tahminine göre fibroin konsantrasyonunu ölçün. Bir tartmak tekne içine ipek solüsyonu 1 ml dökün. 2 saat süre ile 60 ° C 'de fırında örnek kurutun. Kuru ipek fibroin tartılır ve 100 ile ipek çözeltisi beklenen konsantrasyon elde edilen ağırlık çarpılarak ipek fibroin çözeltisi konsantrasyonunu hesaplamak 6-9% (a / h). Damıtılmış su içinde seyreltilmesi ile (ağırlık / hacim)% 6 ipek konsantrasyonu ayarlayın. Durdurma noktası: Sıvı ipek fibroin kapalı bir kapta en fazla bir ay süreyle 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Ipek çözeltisinden gözenekli iskelelerinin hazırlanması. Granüller daha sonra aşamalarda kullanılacak 500-600 um büyüklüğünde ayrı zerre NaCI Elek. Granül atıns 500 mikron altında ve 600 mikron üzerinde büyüklükte. (15 dakika) Politetrafloroetilen (PTFE) kalıp (Şekil 1) içine 6% ipek çözeltisi 30 ml dökün. Yavaşça ipek üzerine elekten NaCl 60 gr dağılım. Tuz biçimli bir tabakasını elde etmek kabı dokunun. Ipek polimerize etmek için oda sıcaklığında 48 saat inkübe edilir. Polimerizasyonu sonlandırmak ve kalan herhangi bir sıvı buharlaştırılması için 1 saat boyunca 60 ° C'de bir fırında iskelesi ihtiva eden PTFE kalıp yerleştirin. Tuz süzülecektir 48 st için damıtılmış su 2 L ihtiva eden bir beher içinde PTFE kalıp içerik yerleştirin. Suya günde 2-3 kez değiştirin. . Tuz tamamen noktası durdurma dışarı süzülen zaman kalıplardan sünger iskeleleri kaldırın: süngerler dehidratasyon gelen iskeleleri önlemek için kapalı bir kapta 4 ° C'de suya saklanabilir. Hazır olduğunuzda, 5 mm çapında biyopsi yumruk iskeleleri kesip. Yüksekliği yaklaşık 2 mm ulaşmak için iskeleleri Önceden kesilmiş. Pu2 mm çapındaki bir biopsi darbe ucu (Şekil 2A) ile birlikte, skafoldun merkezini NCH. (1 saat) . Noktası durdurma (ıslak döngüsü 121 ° C, 20 dakika) ile sterilize edilmeleri için su içine batırılır iskelesi Otoklav: süngerler dehidratasyon iskeleleri önlemek için kapalı bir kapta, 4 ° C sıcaklıkta su içinde daldırılır saklanabilir. Planlanan hücre ekim öncesi steril 0.1 mg / ml poli-D-lisin (PDL) çözelti içinde iskeleleri bırakın. 37 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe edin. Iskeleleri bağlı olmayan PDL çıkarılması için fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez yıkanır. (30 dakika) Rat Kortikal nöronlar 2. izolasyonu Onaylı hayvan protokolü elde edildikten sonra daha önce Pacifici ve Peruzzi 27 tarafından açıklandığı gibi embriyonik günden itibaren 18 (E18) Sprague-Dawley sıçanları korteks parçalara ayır. (2 saat) 3, 20 dakika boyunca (sığır pankreasından)% 0.3 DNase I ile% 0.25 tripsin 5 ml 10 korteksleri inkübe7 ° C. 1 mg / ml soya fasulyesi proteinin eşit bir hacminin eklenmesiyle tripsin inaktive. Tek bir hücre süspansiyonu oluşturulur kadar pipetleme 10 ml pipet kullanarak Pasteur korteks ve aşağı 20 kez Karışım. Nazik olun ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek. (10 dakika) 5 dakika boyunca 127 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Yeniden askıya kültür ortamında 10 ml hücre pelletini (Neuro temelli vasat, 1 x B27 takviyesi, 1x Glutamax,% 1 penisilin / streptomisin). Hücreleri saymak. Beklenen hücre konsantrasyonu yaklaşık 2×10 7 / ml'dir. (20 dakika) 3. Meclis ve Kültür Construct Hücrelerle İskele tohumlama. Bir hücre kültürü kaput içinde steril iskeleleri ve gerekli tüm eşyaları taşıyın. Kullanma steril forseps bir 96-yuvalı hücre kültürü plakasında iskeleleri de başına bir iskele tahsis yerleştirin. (10 dakika) Bunları önce, tohum hücre dengelenmeye hücre kültür ortamı içinde iskelesi bırakıning. 37 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe edin. (10 dakika) Iskeleler ortamın aşırı aspire. Hücre süspansiyonu / iskele 100 ul uygulayın. (10 dakika) Iskele hücre bağlanmasına olanak sağlamak için 37 ° de CO / N hücreleri inkübe edin. Ertesi sabah olmayan bağlanmış hücreler aspire 200 ul / oyuk taze kültür ortamı uygulanır. (10 dakika) Kollajen matrisi ile gömme Temel Yapı. (2 saat) Ben buz üzerinde kollajen 10x PBS, su, 1 N NaOH ve sıçan kuyruğu yerleştirin. Üreticinin talimatlarına göre kollajen çalışma çözeltisi hazırlayın. Hücre-numaralı seribaşı yapıları (1 saat kadar) hazır olana kadar buz üzerinde koruyun. Inkübatör hücre numaralı seribaşı ipek yapıları çıkarın ve ortamın aşırı aspire. Kullanma steril forseps oyuklu bir plaka üzerinde boş oyuklara iskeleleri transferi ve 3 mg / ml kolajen çözeltisi 100 ul her bir iskele bırakın. Geri doku kültürü plakasınıinkübatörde 30 dakika kollajen polimerizasyonunun izin vermek için. De / önceden ısıtılmış hücre kültür ortamında 100 ul uygulanır. Kültür bir hafta orta sadece yarısı hacmini değiştirerek her gün orta değiştirmek için yapıları. 4. Mikroskopi Analizi Canlı / ölü boyama (1 saat) Propidium iyodür (PI) damıtılmış su içinde 1 mg / ml (1,5 mM) stok çözelti hazırlayın. Aseton floresandiasetat (FDA) 2 mg / ml stok çözelti hazırlayın. PBS içinde seyreltilmiş 10 uM PI ve 0.15 uM FDA içeren çalışma çözeltisi hazırlayın. Bir su banyosu içinde 37 ° C'ye kadar çözüm önceden ısıtın. Serum esterazlar kaldırmak için önceden ısıtılmış hücrelerin PBS ile yıkayın. PBS aspire. 2 dakika için hücreler ile ilgili önceden ısıtılmış çalışma çözeltisi uygulanır ve PBS ile yıkayın. FDA eski λ = 490 n; görüntüye epifluorescent mikroskop kullanın hücreleri (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nmm, em λ) 514 nm =. Leke 40 dakika boyunca sabit kalır. Uzun süreli boyama PI hücreleri tarafından alınması ve hücrelerinde PI / FDA eş-lokalizasyonu kaynaklanan spesifik olmayan boyama ile sonuçlanabilir. Immün Kültür Arzu edilen zaman noktasında oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) ile hücrelerin tespit. Nedeniyle PFA toksisitesine sabitleme adımının kimyasal çeker ocak içinde yapılmalıdır dumanı. . 3x PBS durdurma noktasına sahip iskeleleri yıkayın: PFA sabit yapılar daha başka aşamalar ile devam etmeden önce, birkaç gün 4 ° C'de PBS içinde saklanabilir. 4 ° C 'de primer antikor O / N içeren PBS içinde% 0.2 Triton,% 0.25 sığır serum albümini (BSA) iskeleleri inkübe edin. Ertesi gün, boyama çözeltisi atılır ve bağlanmamış birinci antikorları ayıklamak için PBS ile iskeleler 3 x 30 dakika yıkama. 2 PBS içinde% 0.2 Triton içinde seyreltilmiş sekonder antikor,% 0.25 BSA ile inkübe edinoda sıcaklığında sa. Boyama çözeltisini çıkarın ve Bağlanmamış ikinci antikorları ayıklamak için PBS ile iskeleler 3 x 30 dakika yıkama. Görüntü 1 mikron adım numune 100 mikron z-bölümleri alarak 20X amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak iskeleler. Görüntü çözünürlüğü en az 1024 x 1024 piksel olmalıdır ince nevritlerle görselleştirmek için. RNA, DNA ve protein izolasyonu Not: RNA, DNA ve protein izolasyonu üretici talimatlarına uygun olarak bir ticari AllPrep DNA / RNA / Protein Mini Kit kullanılarak gerçekleştirilir. Kullanımı steril forseps 2 ml steril tüpe kültür plaka dışına iskeleleri aktarın. Tüp başına tek bir iskele yerleştirin. Her tüpe RLT tamponu 200 ul ekle. Steril microscissors ile parçalamadan tarafından yapı bozar. Kesintiye doku homojenize, spin kolona tüpün içeriğini aktarmak. Bir mikrosantrifüj tam hızda 2 dakika süreyle Spin.Bu spin kolon boyunca geçerken lizat homojenize edilir. Aracılığıyla akışını toplamak ve RNA, imalatçı protokolü aşağıdaki DNA ve protein izole etmek için hemen kullanabilirsiniz. Nükleik asitlerin verim uyumlu herhangi bir yöntem (örneğin, NanoDrop) ölçmek. Üreticinin talimatlarına uygun olarak BCA protein deneyi kullanılarak protein verimi ölçmek. Dalga boyu 562 nm mikroplaka okuyucu kullanarak tahlil sonuçlarını ölçün. Not: nükleik asit ve hücre yoğunluğuna göre bir yapı için protein beklenen verim Şekil 4 'de gösterilmiştir.

Representative Results

Çörek şekli Katı ipek süngerler hazır kesilmiş sinir dokusu (Şekil 2A) benzeyen bir mimarisi bölümlere ulaşmak için benzersiz ve basit bir fikri temsil etmektedir. Küçük bir hacim içinde tohumlama ve yüksek hücre yoğunluğuna büyümesini sağlayan son derece yüksek bir yüzey alanı içinde yaklaşık 500 um sonuç gözenek boyutlu iskele oldukça gözenekli bir yapı (2×10 7 / ml) (Şekil 2B). Ayrıca, iskelenin yüksek gözeneklilik genişletilmiş zaman dilimlerinde üzerinde yoğun hücre kültürlerinin üstün canlılığı ile sonuçlanan besin ve atıkların sınırsız yayılması için izin verir. Nöronlar tohumlama sonra hızlı bir şekilde ve homojen bir skafold gözenek yüzeyine bağlanır. Hücre bağlanma tamamlandığında ve hücreler, ipek alt-tabaka üzerinde dengelenir sonra, sünger skafold aksonal ağı oluşumu (Şekil 3 için 3 boyutlu bir ortam sağlamak amacıyla yumuşak kolajen matriks ile doldurulur </strong>). Nöronların sadece 2B yüzeyler (Şekil 3B) ile bulunduğu gibi karışık ağlarda elde edilen gözenek yüzeyi üzerinde uzantılar büyüdükçe kollajen matris yokluğunda akson ve hücre gövdeleri bölmelere mümkün değildir. Bunun aksine, kollajen jel nöronal hücre gövdeleri ipek iskele (Şekil 3C) bağlı kalır ise, 3D geniş aksonal dış gelişimini destekleyen bir ağ örgüsü içerir. Bu büyüme paterni hücre gövdeleri ve saf aksonal ağlarda beyinde korteks gri ve beyaz madde benzer (Şekil 3D), compartmentalization yol açar. Ayrı mikroskopisi, konstruktlar deney arkasındaki soruya bağlı olarak, diğer yöntemlerle 18 çeşitli değerlendirilebilir. Örneğin, konstruktların DNA, RNA ve protein izolasyonu kolayca ticari kitler (Şekil 4) kullanılarak gerçekleştirilmiştir olabilir. Nükleik asitler ve protein pe verimir yapı başlangıçta ipek iskelelerinin numaralı seribaşı hücrelerin sayısına bağlıdır. Daha fazla Hücreler DNA, RNA ve protein verimi artar. Ipek sünger iskele hazırlanmasında kullanılan Şekil 1. PTFE kalıp ölçüleri:.. 10 cm çapında, 2 cm yüksekliğinde bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2. 3B beyin gibi doku modeli. (A) Gözenekli ipek sünger iskele. Daha önce kolajen (yeşil-canlı hücreler, kırmızı ölü hücreleri) gömme ipek iskele üzerinde tohumlama üzerine günde 1 nöronların (B) Canlı / ölü boyama. Sağ tarafta Panelleri ma göstermekKırmızı çerçeveli yakalanan alanın gnification. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3. nöronal 3D beyin gibi doku modelinde bölümlere akıbet (A) İskele bölmeleri:. Kırmızı hücre gövdesi bölmesi, Mavi-aksonal bölmesi. (B) kollajen katıştırma önce tohumlama üzerine 1 gün de Nöronal büyüme paterni. (C). Hücre gövdesi bölmesinde tohumlama üzerine günde 7 nöronal akıbet. (D) akson bölmeye tohumlama üzerine 7. günde Nöronal sonucudur. Yeşil -. ΒIIITubulin bu büyük halini görmek için tıklayınızrakam. (A) RNA ve DNA ve iskele başına seribaşı hücrelerin miktarına bağlı olarak yapı başına (B) protein Şekil 4. Beklenen verim (± SD, n = 5). Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .

Discussion

Here we described the guidelines to assemble a compartmentalized 3D brain-like tissue model. The model is characterized by dense polarized culture of neurons resulting in the development of two morphologically different compartments: one containing densely packed cell bodies, second containing pure axonal networks. Overall, the scaffold architecture and growth pattern mimic brain cortical tissue including the six laminar layers and white matter tracts21.

The donut-shaped silk protein-based tissue model allows for modifications and tuning of mechanical properties, versatile structural forms, hydrogel fillers and cellular components. Thus, this tissue model establishes a base platform for a wide range of studies. Silk is a favorable candidate for biomaterial platforms due to its biocompatibility, aqueous-based processing, and robust mechanical and degradation properties22. The silk matrix also serves as a stable anchor to reduce collagen gel contraction over time in culture. The properties such as silk concentration and porosity of the scaffold used in this model have been previously adjusted to achieve optimal cell growth and mechanical properties resulting in brain-like tissue elasticity18,23,24. We suggest to keep these parameters constant to ensure the successful outcome and reproducibility of the experiments.

The 3D neuronal network formation was achieved by combining two types of biomaterials with different mechanical properties: a stiff scaffold to provide neuronal anchoring and a softer gel matrix to permit axon penetration and connectivity in 3D. Selective material preferences of the silk scaffold and soft hydrogel provide the underlying principle for compartmentalizing the neurons from the axonal connections. Due to the inert nature of the silk scaffold, functionalization with poly-D-lysine is required for neuronal attachment. However, other cell adhesion promoting factors can be applied such as RGD25 or fibronectin26. To achieve the 3D network formation the silk scaffold needs to be filled with hydrogel in a timely manner as soon as neurons are attached to the scaffold. Likewise, the collagen matrix filler can be replaced by other hydrogels, thus allowing the study of the influence of 3D extracellular environments on axonal network formation to serve as a platform to evaluate novel hydrogels in terms of neuronal compatibility. Additionally, apart from rat cortical neurons other neuronal sources such as hippocampal neurons or induced pluripotent cell (iPSc)-derived neurons can be utilized. Moreover, the tissue model can be used to study heterocellular interactions by including glial cells along with neurons and to build more complex brain-like tissue.

As shown previously, our model can be utilized to evaluate neuronal functionality in 3D microenvironment with a variety of assays such as cell viability, gene expression, LC-MS/MS and electrophysiology, thus demonstrating physiological relevance of the model18. Other methods, which are frequently utilized to evaluate 3D tissue-engineered constructs, such as immunostaining and microscopy8,9,11 can also be used to assess cell distribution and extent of axonal network formation. However, it has to be noted, that due to the high density of the collagen matrix, the penetration of antibodies and depth of the imaging is limited to few hundred micrometers. Moreover, the signal to noise ratio may be affected by nonspecific background fluorescence. This can be overcome by using lipophilic cell tracers and genetically expressed fluorescent proteins which diminish the need for immunostaining11. Alternatively, the imaging can be performed with 2-photon microscopy instead of usual one-photon technique, which may reduce the signal loss, photobleaching, and can be extended to several hundred micrometers of depth.

Summarizing, the silk and collagen-based brain-like tissue offers a robust platform to study neuronal networks in 3D and is a starting point for the development of more advanced models of neurological disorders in the future. Independent from the mode of evaluation, the relative simplicity of this tissue model supports its utility, success and reproducibility.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the laboratory of Dr. Stephen Moss for providing embryonic rat brain tissues. M.D.T. designed the original protocol. This work was funded by National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. was supported with Postdoctoral Fellowship from German Research Foundation (DFG) (CH 1400/2-1).

Materials

Na2CO3 Sigma-Aldrich 223530 –
LiBr Sigma-Aldrich 213225 –
MWCO 3500 dialysis cassettes  Thermo Fisher 66110 –
Heating plate Fisher Scientific Isotemp –
Centrifuge 5804 R Eppendorf – –
Sieve Fisher Scientific – No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold – – made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl Sigma-Aldrich 71382 –
Biopsy Punch 5mm World Precision Instrument 501909 –
Biopsy Punch 2mm World Precision Instrument 501908 –
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-5MG final concentration 10 ug/ml, dissolved in water
PBS Sigma-Aldrich D1283-500ML –
Trypsin Sigma-Aldrich T4049-500ML –
DNase Roche 10104159001 final concentration 0.3%
Soybean protein Sigma-Aldrich T6522-100MG final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium Gibco 21103049 warm up to 37°C before use
B27 supplement 50x Gibco 17504-044 –
Glutamax Gibco 35050-061 –
Penicilin Streptomycin Corning 30-002-CI –
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 final concentration 3 mg/ml
NaOH Sigma-Aldrich S2770 corrosive
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4170-10MG toxic
Fluorescein Diacetate Sigma-Aldrich F7378-5G –
Olympus MVX10 Olympus – –
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-10G –
anti-βIIITubulin antibody  Sigma-Aldrich T2200 rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546 Molecular Probes A11010 goat 1:250
goat serum Sigma-Aldrich G9023-5ML –
Leica SP2 confocal microscope Leica – objective 20x
QIAshredder Qiagen 79654 –
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit Qiagen 80004 –
Ethyl alcohol, Pure Sigma-Aldrich E7023  –
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific – –
BCA protein assay Thermo Scientific 23225 –
Plate reader Spectramax M2 Molecular Devices – absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type TedPella 1346 –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. Neurological Disorders. , (2005).
  2. Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).
  3. Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).
  4. Wesseling, H., et al. A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).
  5. Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures. Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).
  6. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  7. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  8. Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).
  9. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  10. Hogberg, H. T., et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther. 4, S4 (2013).
  11. Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly. Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).
  12. Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel. Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).
  13. Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells. Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).
  14. Gurkan, U. A., et al. et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures. Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).
  15. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).
  16. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature. 2 (8), 599-605 (2005).
  17. Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity. J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).
  18. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).
  19. Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).
  20. Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).
  21. Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts. Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).
  22. Vepari, C., Kaplan, D. L. Silk as a biomaterial. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).
  23. Yao, D., et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).
  24. Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).
  25. Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).
  26. Hopkins, A. M., et al. Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering. Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).
  27. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol. Vis. Exp. (63), e3965 (2012).

Tags

Silk-collagenPolarized NeuronsBrain-derived NeuronsNeural NetworkAxonal GuidanceCell-cell InteractionCell-matrix InteractionElectrical Function

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chwalek, K., Sood, D., Cantley, W. L., White, J. D., Tang-Schomer, M., Kaplan, D. L. Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue. J. Vis. Exp. (104), e52970, doi:10.3791/52970 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image