内皮细胞粘附性定量<em>在体外</em

1.准备玻璃盖玻片消毒直径12mm圆形盖玻片通过浸泡在70％乙醇中至少10分钟，偶尔搅拌，以确保所有的盖玻片的乙醇的总暴露。倒入玻璃盖玻片和乙醇进入无菌细胞培养皿（无论是6厘米直径10厘米）。 有一对无菌细5B镊子，拾取和放置每个单独的玻璃盖玻片成24孔簇平板的孔。小心确保盖玻片不接触孔的侧面和大致在井的中间。 离开未覆盖的24孔丛板盖玻片在流柜干燥。这大约需要10分钟在此期间，由于Hank氏平衡盐溶液（HBSS），以0.1mg / ml的稀释10mg / ml的人纤连蛋白制备的涂料混合物。 当盖玻片是干的，吸移管100微升的涂敷液涂敷到每个玻璃共verslip所以该溶液仅覆盖玻璃而不围绕着阱的外面汇集。将覆盖24孔簇板中的细胞培养孵化器的至少一个小时。 在使用前，除去包衣液。在相同的涂层溶液可以转移到无菌管中并用高达三倍与疗效没有可见损失。 2.制备内皮细胞单层培养的人冠状动脉内皮细胞（EC），在培养基中，在37℃和5％的二氧化碳。 吸过的文化传媒和冲洗EC单层用10毫升HBSS 关闭吸HBSS和加入2ml 0.5％胰蛋白酶，0.2％EDTA溶液。在室温下孵育约5分钟。 当乳油可以通过抽头到烧瓶的一侧脱落，加入5毫升大豆胰蛋白酶抑制剂和与吸管喷出烧瓶的表面，以进一步去除细胞。 转移细胞到15ml试管并离心管在200×g离心5分钟。 吸上清，悬浮颗粒欧盟在5毫升的媒体。计数细胞用血球计和每毫升乳油介质的调节细胞浓度至50,000乳油。 分配将1ml细胞悬浮液放入24孔板含有涂覆的玻璃盖玻片上的每个孔中。孵育细胞的O / N的细胞培养孵化器在37℃下加5％的二氧化碳。 细胞准备用于实验时汇合单层形成时，在3天内。 3.准备的单核细胞转移的HL-60细胞，在RPMI培养在补充有10％胎牛血清，在悬浮培养，进15毫升管中。离心细胞，在200×g离心5分钟。 除去上清液和重悬细胞在5ml介质和调节细胞浓度与媒体200万细胞/ ml。如果的HL-60荧光标记是期望的，重悬细胞在RPMI无血清和公关在第4节中描述oceed。 添加0.5的HL-60细胞悬浮液毫升到含乳油单层的24孔簇平板的每个孔，并培育该板在细胞培养培养箱中于37℃和5％二氧化碳的时间1和3之间的选择的固定时间段小时。有点不同的是1小时和3小时的时间点，其中结合饱和度达到之间观察到。 准备细胞清洗/收获：填写120毫升管用100毫升的HBSS。分配1毫升福尔马林成新鲜24孔板的每个孔中。 培养结束后，使用一对锋利的钳子，拿起玻璃盖玻片从井中并保持盖玻片垂直和民建联盖玻片的边缘上的一块组织在板凳上3秒，注意不要触碰与组织盖玻片细胞覆盖表面。 用钳子紧紧握住盖玻片，扣篮盖玻片进出的HBSS五倍。 第五次扣篮后在HBSS中，轻拍盖玻片边缘上的组织，持续3秒。 重复3.6和3.7中描述的扣篮和涂抹程序，合共三套5次扣篮之后轻拍。 转移盖玻片成孔含有10％福尔马林固定细胞在RT。盖玻片准备枚举，用于长期贮存或将要进行下面描述的其他程序。 4.标签HL-60细胞与细胞的跟踪（可选） 计数和转移HL-60细胞（ 如 10元）的适量入15ml离心管中。离心机HL-60细胞，在200×g离心5分钟。去除上清液。 重悬细胞沉淀在RPMI培养基细胞追踪无血清以1百万个细胞/ ml的浓度。孵育细胞在细胞培养孵化1小时。 离心细胞，在200×g离心5分钟，丢弃上清液。悬浮细胞沉淀在媒体上200万℃的浓度ELLS /毫升。 加入0.5毫升细胞跟踪标记的HL-60到生长在玻璃盖玻片每孔含有内皮细胞。继续在3.3。 5.枚举胶粘剂内皮细胞山盖玻片DAPI反染色在显微镜载玻片上识别单个细胞。 使用倒置显微镜用4X或10X的目标，收购的几个字段（ 例如，5场）的图像和计数的最高数字，聚集在未经照射的血管内皮细胞的单核细胞（这通常应该是3-5）。 两次这个号码设定为单核细胞上的内皮细胞的阈值也可以是定义为一个群集。如果需要的话，不同的标准可以被用于限定根据实验的性质的集群。 算簇的数目和内皮细胞中的场数。除以前者由后者来获得的粘合剂的内皮细胞的百分比。得分众多领域获得的计数的平均值和标准偏差。 6.复染带抗体后在盖玻片的粘附实验及细胞已在RT固定在10％福尔马林进行15分钟，使用标准的过程10和选择的抗体若使盖玻片免疫荧光。 添加和删​​除各种解决方案非常轻柔，避免撞出了附着于内皮细胞单核细胞。 7.复染的衰老相关的β-半乳糖苷酶活后在盖玻片的粘附实验及细胞已在福尔马林中固定15分钟，染色为衰老相关的β-半乳糖苷酶的活性作为伴随染色试剂盒说明书所述。添加和删​​除各种解决方案非常轻柔，避免撞出了附着于内皮细胞单核细胞。