Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Disturbi dello sviluppo neurologico sono un gruppo di disturbi come la sindrome di Down, la sindrome X fragile (FXS), la sindrome di Rett, neurofibromatosi, sclerosi tuberosa e ASD, in cui lo sviluppo e la maturazione del sistema nervoso centrale (SNC) è disturbato nella fase iniziale un'ampia ed eterogenea il periodo prenatale ^1. Queste disfunzioni dello sviluppo cerebrale possono causare profondi effetti per tutta la vita sulla funzione motoria, il linguaggio, l'apprendimento e il processo della memoria. Una pletora di fattori genetici e ambientali sono stati implicati nella patogenesi di disordini dello sviluppo neurologico negli ultimi anni ^2,3. Anche se i meccanismi molecolari alla base del fenotipo clinico rimangono sconosciute, i risultati di cui sopra hanno permesso lo sviluppo di diversi modelli murini di questi disturbi. Apprendimento e memoria deficit sono stati identificati in un certo numero di questi modelli di topo, come Tsc1 ^+/-, TSC2 ^+/-,Nf1 ^+/- e En2 ^{– / –} mice ^2,4-7. Una sfida importante nel campo dei disturbi del neurosviluppo è l'identificazione dei processi cellulari e molecolari alla base della memoria e dell'apprendimento erettile. Vie di segnalazione selezionati attivate durante l'apprendimento o la memoria possono indurre la trascrizione di geni specifici e alla fine porterà a de novo sintesi proteica. Geni immediati-precoce (IEGs) attivazione e proteine-dipendente modifiche sinaptiche stanno rapidamente indotte in neuroni del cervello in risposta all'attività neuronale e formazione comportamentale ^8,9.

Deficit di vie di segnalazione che coinvolgono neurofibromin sono stati associati con l'apprendimento compromessa in disturbi dello sviluppo neurologico. Neurofibromin è il prodotto del gene NF1, cui mutazione provoca neurofibromatosi tipo 1, una sindrome genetica complessa caratterizzata da tumori del sistema nervoso, ritardi comportamentali e motorie e cognitive disabilità ^10. Eterozigoti Mice per Nf1 cancellazione limitata ai neuroni inibitori mostrano deficit nella prima fase di potenziamento a lungo termine (LTP), così come l'apprendimento spaziale compromessa MWM ^5,11,12. È interessante notare che la carenza Nf1 in questo modello di topo porta ad una attivazione eccessiva di segnalazione Ras in interneuroni inibitori durante l'apprendimento, con conseguente aumento della fosforilazione ERK ed infine in un miglioramento anormale di rilascio di GABA da questi neuroni ^5.

Sulla base di questi risultati, la visualizzazione dell'attività neuronale dopo compiti comportamentali rappresenta un modo per ricostruire i circuiti specifici coinvolti in malattie dello sviluppo neurologico. Il protocollo immunoistochimica qui descritta ha lo scopo di valutare e quantificare dell'ippocampo livelli di fosforilazione ERK seguenti MWM in un modello di topo con ASD deficit cognitivi. MWM è ampiamente utilizzato per studiare dipendente apprendimento spaziale dell'ippocampo e la memoria nei roditori ^13,14 </sup>. Decidiamo di utilizzare ERK fosforilazione come lettura molecolare di apprendimento ippocampo compito-dipendente, dal momento che ERK ha dimostrato di avere un ruolo essenziale nell'apprendimento e nella memoria la formazione ^15. Inoltre, il percorso ERK è necessaria per la plasticità esperienza-dipendente in via di sviluppo corteccia visiva ^16. Infine, topi privi di uno dei due isoforme (ERK ERK2) in mostra CNS contrassegnati anomalie nei comportamenti cognitivi, emotivi e sociali ^17, che indica che la segnalazione ERK potrebbe giocare un ruolo fondamentale nella patogenesi di disturbi dello sviluppo neurologico, come ASD.

Abbiamo usato engrailed 2 knockout (En2 ^{– / -)} topo come modello di disturbi dello sviluppo neurologico. En2 ^{– / –} topi mostrano le caratteristiche anatomiche e comportamentali "ASD-like", tra cui la perdita di interneuroni prosencefalo ^18, ridotta espressione di geni ASD-correlati ^19, diminuzione socialità, e la flessibilità cognitiva ^6,7,20. Learni spazialeng e difetti di memoria, come quelli rilevati in MWM, sono particolarmente robusti in En2 ^{– / –} mice ^6,7 e potrebbero essere rilevanti per i deficit cognitivi osservati nei pazienti ASD ^21. Inoltre, abbiamo dimostrato che alterata apprendimento spaziale in MWM è associata con l'espressione neurofibromin ridotti e aumento dei livelli di Perk nel ilo di En2 ^{– / –} topi adulti ^7. Qui vi presentiamo il protocollo dettagliato per la caratterizzazione immunoistochimica di pERK seguito MWM in questo modello di topo ASD.