التصور المناعى من الحصين العصبية آخر بعد المكانية التعلم في نموذج الفأر من الاضطرابات العصبية النمائية
Summary
وصفنا بروتوكول المناعية لدراسة الملف الشخصى تنشيط الخلايا العصبية قرن آمون بعد التعرض لمهمة التعلم المكاني في نموذج الفأر تتميز العجز المعرفي من أصل النمو العصبي. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لكلا النموذجين الماوس وراثية أو الدوائية تتميز العجز المعرفي.
Abstract
تحريض فسفرته كيناز الخلية التنظيم (بيرك) هو قراءات الجزيئية الموثوقة التي تعتمد على التعلم تنشيط الخلايا العصبية. هنا، نحن تصف بروتوكول المناعية رفع معنوياته لدراسة الملف الشخصى تنشيط الخلايا العصبية قرن آمون بعد التعرض لمهمة التعلم المكاني في نموذج الفأر تتميز العجز المعرفي من أصل النمو العصبي. على وجه التحديد، وكنا المناعية رفع معنوياته لدراسة تفعيل الخلايا العصبية التالية موريس المياه متاهة (MWM، وهي مهمة التعلم المعتمد على الحصين الكلاسيكية) في Engrailed-2 بالضربة القاضية (En2 – / -) الفئران، وهذا نموذج من اضطرابات طيف التوحد (ASD). بالمقارنة مع النوع البري (WT) الضوابط، En2 – / – أظهرت الفئران عجز التعلم المكاني كبيرة في MWM. بعد MWM، تم الكشف عن اختلافات كبيرة في عدد الخلايا العصبية رفع معنوياته إيجابية في الحقول الفرعية الحصين محددة من En2 – / – الفئران، بالمقارنة مع الحيوانات WT. وبالتالي، يمكن لدينا بروتوكول كشف بقوة الاختلافات فيالخلايا العصبية رفع معنوياته الإيجابية المرتبطة ضعف التعلم المعتمد على الحصين في نموذج الفأر من ASD. بشكل أعم، لدينا بروتوكول يمكن تطبيقها على التحقيق في الملف الشخصى تفعيل الخلايا العصبية قرن آمون في كلا النموذجين الماوس وراثية أو الدوائية تتميز العجز المعرفي.
Introduction
وتشمل الاضطرابات العصبية النمائية مجموعة واسعة وغير متجانسة من الاضطرابات مثل متلازمة داون، متلازمة X الهش (FXS)، متلازمة ريت، الورم العصبي الليفي، التصلب درني وASD، والتي تشعر بالانزعاج تطوير ونضوج الجهاز العصبي المركزي (CNS) في وقت مبكر خلال فترة ما قبل الولادة 1. ويمكن لهذه الاختلالات التنموية الدماغ يسبب عميقة، تأثير مدى الحياة على وظيفة الحركة واللغة والتعلم وعملية الذاكرة. هناك عدد هائل من العوامل الوراثية والبيئية قد تورطت في التسبب في اضطرابات النمو العصبي خلال السنوات القليلة الماضية 2،3. حتى لو الآليات الجزيئية الكامنة وراء النمط الظاهري السريرية لا تزال مجهولة، فإن النتائج المذكورة أعلاه قد سمحت تطوير عدة نماذج الماوس من هذه الاضطرابات. وقد تم تحديد العجز في التعلم والذاكرة في عدد من هذه النماذج الماوس مثل TSC1 +/-، TSC2 +/-،NF1 +/- وEn2 – / – الفئران 2،4-7. تحديا هاما في مجال اضطرابات النمو العصبي هو تحديد العمليات الخلوية والجزيئية الكامنة والذاكرة والتعلم اختلال وظيفي. يمكن مسارات الإشارات اختيار تفعيلها خلال التعلم أو الذاكرة لحث على نسخ من جينات معينة وتؤدي في نهاية المطاف إلى دي نوفو تخليق البروتين. وبفعل الجينات المباشرة في وقت مبكر (IEGs) تفعيل والتي تعتمد على البروتين التعديلات متشابك بسرعة في الخلايا العصبية في الدماغ ردا على نشاط الخلايا العصبية والتدريب السلوكي 8،9.
وقد ارتبطت العجز في مسارات الإشارات التي تنطوي على neurofibromin مع ضعف في التعلم في الاضطرابات العصبية النمائية. Neurofibromin هو نتاج الجين NF1، الذي يسبب نوع الورم العصبي الليفي 1، متلازمة وراثية معقدة تتميز أورام الجهاز العصبي، والتأخير السلوكية والحركية، وديسا المعرفي الطفرةbilities 10. متخالف الفئران لNF1 حذف يقتصر على الخلايا العصبية المثبطة تظهر عجز في المرحلة المبكرة من التقوية على المدى الطويل (LTP)، وكذلك التعلم المكاني للخطر في MWM 5،11،12. ومن المثير للاهتمام، ونقص NF1 في هذا النموذج الماوس يؤدي إلى تفعيل أكثر من رأس الإشارات في interneurons المثبطة أثناء التعلم، مما أدى إلى زيادة الفسفرة ERK وأخيرا في تعزيز الشاذ الإفراج GABA من هذه الخلايا العصبية 5.
وبناء على هذه النتائج، والتصور من نشاط الخلايا العصبية بعد المهام السلوكية يمثل وسيلة لإعادة بناء الدوائر المحددة المعنية في الأمراض العصبية النمائية. بروتوكول المناعية الموصوفة هنا يهدف إلى تقييم وقياس مستويات ERK الفسفرة الحصين التالية MWM في نموذج الفأر ASD مع العجز المعرفي. ويستخدم على نطاق واسع MWM للتحقيق الحصين التعلم المكاني يعتمد والذاكرة في القوارض 13،14 </sتصل>. قررنا استخدام ERK الفسفرة كما قراءات الجزيئية التعلم قرن آمون التي تعتمد على المهمة، منذ ظهر ERK أن يكون لها دورا أساسيا في التعلم والذاكرة تشكيل 15. وعلاوة على ذلك، فإن مسار ERK ضروري لتعتمد على خبرة ليونة في القشرة البصرية تطوير 16. أخيرا، الفئران التي تفتقر إلى واحد من اثنين ERK وإيسفورمس (ERK2) في المعرض CNS ملحوظ الشذوذ في السلوك المعرفي والعاطفي والاجتماعي 17، مشيرا إلى أن ERK إشارات قد تلعب دورا حاسما في التسبب في اضطرابات النمو العصبي مثل ASD.
كنا Engrailed 2 بالضربة القاضية (En2 – / -) الفئران كنموذج للاضطرابات النمو العصبي. En2 – / – أظهرت الفئران الخصائص التشريحية والسلوكية "ASD تشبه"، بما في ذلك فقدان interneurons الدماغ الأمامي 18، خفضت التعبير عن الجينات المرتبطة ASD-19، وانخفضت مؤانسة، والمرونة الإدراكية ضعف 6،7،20. learni المكانينانوغرام وعيوب الذاكرة، مثل تلك الحالات المكتشفة في MWM، هي قوية خصوصا في En2 – / – الفئران 6،7 و قد تكون ذات صلة إدراكيا لوحظت في مرضى ASD 21. وعلاوة على ذلك، أظهرنا أن التعلم المكاني ضعف في MWM يرتبط مع انخفاض التعبير neurofibromin وزيادة مستويات رفع معنوياته في نقير En2 – / – الفئران البالغة 7. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لتوصيف المناعى لرفع معنوياته بعد MWM في هذا النموذج الماوس ASD.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، ونحن نقدم بروتوكول المناعية رفع معنوياته للكشف عن تنشيط الخلايا العصبية التالية MWM في En2 – / – الفئران، نموذج الفأر من الاضطرابات العصبية النمائية. تم الكشف عن انخفاض مستويات رفع معنوياته في الحقل الفرعي CA3 من En2 – / – المسوخ مقارنة WT. بشكل مختلف عن ما لوحظ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الموظفين الإداريين من CIBIO (جامعة ترينتو) ومعهد علم الأعصاب CNR للحصول على المساعدة. ويدعم جيوفاني بروفنزانو التي كتبها زمالة ما بعد الدكتوراه من FONDAZIONE فيرونيسى (ميلان الايطالي). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الوزارة الإيطالية للجامعة والبحث (PRIN 2008 منحة # 200894SYW2_002 وPRIN 2010-2011 منحة # 2010N8PBAA_002 إلى YB)، جامعة ترينتو (CIBIO بدء منحة لYB) ومؤسسة تيليثون (منحة # GGP13034 ل YB).
Materials
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto – Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| Image J software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
- Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
- Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
- West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
- Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
- Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
- Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
- Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
- Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
- Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O’Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
- Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
- Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
- Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
- Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
- Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
- Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
- Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
- Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
- Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
- Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).
