Belirli Duyu Hücre bağıntılı Konfokal ve 3D Elektron Mikroskobu

Tüm hayvan bakımı ve deneyler Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol uyarınca yapılmıştır. Cocem3D daha önce yayınlanmış protokollere 10,11 bir kombinasyonundan kaynaklanmıştır ve PyyGFP raportör fare 12 kullanarak belli bir enteroendokrin hücre çalışma için uygulanmıştır. Bu yöntem, hali hazırda ticari olarak temin edilebilen transgenik raportör fareler kullanılarak ilgi diğer hücrelere de uygulanabilir. Korelatif konfokal mikroskopi, seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBEM) ve 3D rendering veriler: yöntem üç bölümlerde açıklanmıştır. Korelatif Konfokal Mikroskop Bu bölümün amacı, karşılıklı konfokal ve SBEM görüntüleme sağlayan boyutları distal kolonda bir doku segmenti hasat etmektir. aşağıdaki gibi protokol: 1. Hasat Doku HazırlamakPBS içinde 50 ug / ml heparin solüsyonu 10 mi. 10 ml ketamin (100 mg / ml) ve xylazine 1 ml (20 mg / ml) karıştırarak ksilazin / ketamin anestezi stok hazırlayın. 0.1M PBS 4: ksilazin / ketamin Stokta 1 seyreltin. PBS içinde% 4 paraformaldehit ve% 0.1 glutar aldehit içinde sabitleyici çözeltisi bir 100 ml hazırlayın. Ksilazin / ketamin anestezik öldürücü bir dozu ile, 6-10 haftalık bir PyyGFP fare anestezisi. Fare ağırlığı 20 g başına 0.15 ml intraperitoneal anestezik enjekte edilir. Kuyruk veya ayak kısma doğru fare anesthetization onaylayın ve kuruluğunu önlemek için gözleri merhem kullanın. Fiksatif intrakardiyak 10 serpmek için bir değişken akış peristaltik pompa kullanın. Cerrahi makas kullanarak (13 cm uzunluğunda) kesim bağırsak, kalp, akciğerler ve ortaya çıkarmak için karın boşluğuna açın. Dar kalıp kavisli bir forseps (12 cm uzunluğunda) ile kalbi tutun ve peristaltik pompa gelen kelebek iğne (19 G) takın iNto sol ventrikül. Hemen, bahar düz makas (uzunluğu 4 mm) sağ atrium kesti. 2 ml'lik bir oranda serpmek / dk, ilk fare kuyruk kadar 15 dakika boyunca buz soğukluğunda sabitleyici çözeltisi ile daha sonra heparin 1 dakika için çözelti ve tamamen katıdır. Not: Bu, bağırsak mukozasında küçük damarların patlamasını önlemek için yavaş bir hızda perfüze edilmesi için çok önemlidir. Gemilerin Patlama dokusunun ultrastrüktür uzlaşma olacak. Perfüzyon yeterli ise, karaciğer 3-5 dakika içinde renk soluk açmalısınız. Kullanımı küçük makas karın boşluğu açın ve distal rektumun için çekum ile kavşağından tüm kolon tüketim. Buz soğukluğunda PBS doku yerleştirin. PBS batmış olsa da, küçük yaylı makas ile mezenter boyunca kolon açık kesti. 2. Doku Bölümleri Kesme ve Sabitleme Bir bisturi kullanılarak, distal kolon ila yaklaşık 6 Küçük doku bölümleri (2 mm2) kesti. Bir yaprak o bu yapınf diş mum ve PBS birkaç damla gömülmüş. 4 ° C 'de 3 saat süre ile sabitleştirici çözelti içinde doku bölümleri sonrası sabitleyin. 3. Mikro-diseksiyon Doku Blokları Agaroz PBS içinde% 5 düşük erime hazırlamak ve 45 ° C'de bir su banyosu içinde muhafaza edin. % 5 agaroz düşük erime standart boyutta Tissue-Tek cryomold gibi, küçük bir plastik kap kullanarak doku segmentleri gömün. Titreşimli bıçak mikrotomda gömülü bölümler monte ve buz gibi soğuk PBS ile tampon tepsisini doldurun. 0.8 genlik ve 0.04 mm / sn hızında 300 mikron doku şeritlerini kesin. Not: Bu noktada, kağıt şeritleri agaroz yerinden edilecektir. Yeniden embed agaroz 300 mikron doku şeritleri ve vibratome en bıçak dik mikrotomda takar. Bir vibratome kullanarak, 50 um kadar bir kalınlıkta doku şeritler kesilir. Not: Nihai doku blokları yaklaşık 300 um genişliğinde x 50 mikron kalınlığında olacaktır. Bunlar dimensions enteroendokrin hücrenin kalınlığı 15-20 mikron ve neuropod uzunluğu 30-70 nm arasında olduğunu göstermiştir Pilot konfokal deneylerden optimize edilmiştir. Hücrenin oryantasyon doku bloğun yüzüne paralel, bu nedenle, bütün bir hücre 50 mikron kalınlığında tarafından dokuya 300 mikron genişliğinde bir blok içinde yer olabilir. Ilgi konusu doku ve hücre tipine bağlı olarak, bu boyutlar değişir. 4 ° C de PBS içinde doku blokları saklayın. 4. Konfokal Görüntüleme 4000: 1 PBS içinde DAPI seyrelterek nükleer leke çözüm hazırlayın. 5 dakika boyunca DAPI Nükleer soya doku blokları inkübe edin. Not: DAPI boyama konfokal ve SBEM görüntüleri ilişkilendirilmesi için yararlı onların çekirdekleri tarafından ayırt tek tek hücrelerin kolaylaştırır. Tahsil cam slayt Mount doku blokları, PBS birkaç damla ekleyin ve bir lamel ile bunları kapatın. Konfokal mikroskop kullanılarak, blok tespitbozulmamış villus ve ilgi PyyGFP hücreleri ile s ve z-process optik bölümleri elde etmek için onları görüntülenmiş. 1 mikron optik bölümleri z-yığınları elde etmek için bir 20X / 0.8 Zeiss Plan Apochromat hedefini kullanın. Z yığın için, başka hücrelere ilişkiyi belirlemek için 405 nm'de (DAPI) kanalları kullanarak 488 nm endojen GFP ilgi hücre lokalize etmek ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) hücre göre konumunu belirlemek için lümen. 1.024 piksel veya daha yüksek görüntü çözünürlüğü kullanın. Agaroz 5. Gömme bloklar PBS içinde% 4 paraformaldehit ve% 2.5 glutar aldehit içinde sabitleyici 10 ml hazırlayın. Dikkatlice doku bloğu zarar vermeden uzak cam slayt lamel slayt kapak kayma kenarları PBS eklenerek cam slayt doku blokları kaldırmak. Sonra, bir 1 slayt doku bloğu aktarmak için bir sanat fırça kullanın.5 Ml% 4 paraformaldehid ve% 2.5 glutaraldehit fiksatif içeren mikrosantrifüj tüp. Sonrası düzeltme doku blokları O / N 4 ° C'de. PBS doku blokları aktarın. Sonra,% 5, iki cam slaytlar arasında onları sandviç agaroz düşük erime düz blokları embed. Not: agaroz ince bir tabaka halinde bloklar gömülmesi boyama esnasında arka manipülasyon kolaylaştırır. Bir meydanda agaroz kesin ve üst tarafta bir çentik yapmak. Not: Bu adım, daha sonraki kademelerde yönünü sağlamak için gereklidir. Daha sonra işlenene kadar 4 ° C 'de PBS ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü saklayın blok. Seri Blok-yüz Taramalı Elektron Mikroskobu (SBEM) Bu bölümde, doku bloğu hazırlanır ve düşük büyütmede SBEM ile görüntülendi. Blok yüz anket görüntü daha sonra ilgi hücreyi içeren bölgeyi tanımlamak için konfokal verilerle ilişkilidir. Bölgede keztanımlanır, doku 7 nm / piksel ve 70 nm dilim çözünürlükte görüntülü. Bu sorunu gidermek ve diğer organelleri büyük yoğun çekirdek salgı veziküller ayırt etmek için yeterli oldu. Enteroendokrin hücrelerde, veziküller, bu tür çapı 13 ila 100 nm ila 150 arasında değişir. aşağıdaki gibi protokol: 6. Boyama Doku Bölümler PBS doku çıkarın ve 0.1 M kakodilat tampon içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın. 1 saat 0.1% tannik asit leke blok hücre zarları 14 kontrastı arttırmak için, 0.1 M kakodilat tampon maddesi içinde çözülmüştür. Yayınlanan protokole göre 11 sonraki boyama ve doku dehidratasyon yürütmek. Deerinck et al izlenerek. Protokol, bu çözüm hazırlanması: 1)% 1 (ağırlık / hacim) thiocarbonhydrazide (THC); 2) aspartat çözüm kurşun; 3)% 1 uranil asetat ve 4) ozmiyum tetraoxyde / potasyum ferrosiyanür (OsO 4 / K ferrosiyanür). % 4 OsO 4 ve 2x karıştırın1 at [10 ml H 2 O K ferrosiyanür ve 0.86 g Na kakodilat ile 0.3] K ferrosiyanür stok: 1 oranında OsO 4 / K ferrosiyanür yapmak. Not: agaroz gömülü doku olması boyama esnasında kullanımını kolaylaştırır. Dikkatle takip eden reçine sızması için agaroz kaldırmak. Durulama numuneler daha sonra, üç, 0.1 M kakodilat tampon içinde katı, her biri 5 dakika, 4 ° C 'de 2 saat süre ile OsO4 / K ferrosiyanür çözeltisi ile boyanır. 60 ° C'de 30 dakika boyunca TCH ultra saf su ile üç kez, her biri 5 dakika ve leke ile durulayın. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca% 2 OsO 4 (Resim K ferrosiyanür) ultra saf suda üç defa, her biri 5 dakika ve leke durulayın. Ultra saf su içinde tekrar üç kere, her biri 5 dakika durulayın. 4 ° C'de /% 1 uranil asetat O ile N Leke. Ultra saf su içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın. 60 ° C'de 30 dakika boyunca talebi aspartat ile Leke. Ultra saf su içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın. Solutio durulayarak dokuları dehydrateEtanol konsantrasyonları artan ns. % 50,% 75,% 85,% 95, ve mutlak% 100 etanol ile 2 defa, her biri 5 dakika durulayın. Sonunda, propilen oksit ile iki kez, 10 dakika her biri bölümleri yıkayın. Reçine 7. sızmakta ve katıştırma doku kesitleri Reçine, ticari olarak avaialble kiti kullanılarak bloklar sızmak. Bir EPON gömme kiti kullanılarak reçine gömün dokular. % 48 Epoksi,% 20 mi DDSA,% 30 mi NMA ve% 2 DMP30 bir reçine karışımı hazırlayın. 5 dakika boyunca kuvvetlice reçine karışımı karıştırın ve daha sonra kabarcıklar yüzeye gelmek için izin 30 dakika süreyle vakum karışımı yerleştirin. 1 de propilen oksit ile reçine karıştırın: 1 oranını ve şiddetle çalkalanır. Dokulardan Nihai dehidrasyon durulama çıkarın ve propilen oksit ile karışık reçine ilave edin. Bir döndürücü O'da örnekleri ile yerleştirin flakon / N ve flakon kapaksız bırakın. Ertesi gün, taze EPON Reçine ekleyebilir ve rotatör içinde 90 dakika boyunca karıştırın. Onları sandviç mümkün olduğunca düz bir reçine gömün bloklarbirbirlerine 15 yapışmasını engellemek için, sıvı salma maddesi ile tedavi edilmiş cam slaytlar arasındadır. Blok, düz gömülü sonra, 60 ° C'de ilave bir 48 saat boyunca blok tedavi. Blokları serbest bırakmak için birbirinden slaytları çekin. 8. Montaj ve Görüntüleme Doku Blok Kırpma Diseksiyon kapsamında, blok kesme önce ilgi hücreleri içeren bölgelerin belirlenmesi kolaylaştırmak için konfokal mikrograflar bununla reçine gömülü doku blokları yönünü maç. Elle aşağı ~ 500 x 500 mm blok yüz reçine gömülü blok Trim. 30 dakika boyunca iletken epoksi ve kuru içeren bir pim üzerine düz blok monte edin. Ardından, 60 ° C'de bir yüzeye ve kuru O / N blok düz koymak. Coat kolloidal gümüş sıvı ile blok. Co kolaylaştırmak için dik açıyla bloğun dilimleme sağlamak için doku kesitleri düz BakımSeri blok yüz ve konfokal mikrografikleri rrelating. 9. SBEM Görüntü SBEM sistemi ile donatılmış bir Taramalı Elektron Mikroskobu kullanılarak blok (e .g., 3View). Set başlangıç ​​kalınlığı ~ 2 mikron artışlarla bölüm ve doku yüz blok çıkana kadar kesti. Tüm blok yüzünün surver görüntü kazanır. Fiji yazılımı kullanarak, sabitleme sırasında ve 16 boyama örnek çözgü için ortak bir payda ve hesap oluşturmak için seri blok yüz ve konfokal hem mikrograflar ölçümleri almak. Konfokal görüntüler koordinatlarına paydayı çarpılarak blok yüzünde ilgi alanını bulun. Bir referans olarak, mikrovillus, goblet hücreleri, ya da lamina propria konumu gibi, aynı zamanda diğer yapısal özellikleri kullanın. En ilgi Görüntü bölge 2.25 kV ve yüksek vakum modunda 7 nm / piksel (veya 15,147X büyütme). Dilim artışları ayarlanması gerekir70 nm ya da daha az. Ham 16-bit .dm3 formatta SBEM verileri toplayın. Yüzey segmentasyonu 10. Optimizasyon SBEM Görüntüler 8-bit tiff ham .dm3 biçiminden SBEM görüntüleri dönüştürün. Fiji 0.8 gaussian blur filtresi kullanarak görüntüleri .tiff Filtre. Orijinal boyutunun% 25'ine veri seti küçültün ve set işlemek için gerekli olan RAM belleği miktarını en aza indirmek için bir .tiff yığınının olarak kaydedin. Çeviri modunda Fiji eklentisi "SIFT lineer yığın uyum" seçeneğini kullanarak SBEM görüntülerin yığınını hizalayın ve "ekin 3D" eklentisi kullanarak kırpılmış. Not: Kırpma daha segmentlere ve volume rendering için gerekli RAM belleği miktarı azalır yardımcı olur. 3D Veri Oluşturma 11. Konfokal Mikroskop Otomatik "yüzeyler" aracı modunu aşmak kullanarak z-yığınları yeniden yapılandırma. Şekil 1D, bir rec gösterirMutlak yoğunluk olarak 0.126 um de yüzeyler alan detay, pürüzsüz seçeneğini kullanarak her kanalın onstruction ve eşikleme. 12. Seri Blok-yüz SEM Not: Manuel veri segmentasyonu çok zaman alıcı prosedür ve birkaç hafta sürebilir prosedürü işlenecek özelliklere bağlı olarak olduğunu. Bohórquez ark sunulan videolar ve şekiller için Segmentasyon. 2014 8 elle yapılır ve emek yaklaşık 500 saat sürdü. Bu bölümleme işlemine başlamadan önce render gerek temel özellikleri öncelik önerilir. Prosedür aşağıdaki gibidir: Beraberlik modunda "yüzeyler" aracını ve ilgi hücreyi hale manuel segment ve hacmi 50 milisaniye modu çizim "kontur" seçeneğini kullanın. Yumuşak render veya daha hızlı render için her 5 dilim için hücrenin her dilim üzerinde konturları Trace. İhracat son im300 dpi veya daha fazla bir çözünürlükte "anlık" aracını kullanarak yaşları.