具体的な感覚細胞の相関共焦点と3次元電子顕微鏡

全ての動物のケアと実験は、デューク大学施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。 Cocem3Dは、以前に公開されたプロトコル10,11の組み合わせから茎とPyyGFPレポーターマウス12を使用して、特定の腸内分泌細胞を研究するために、ここで適用しました。この方法は、商業的に容易に入手可能なトランスジェニックレポーターマウスを用いて、関心のある他のセルに適用することができます。相関、共焦点顕微鏡、シリアルブロック面を走査型電子顕微鏡（SBEM）、及び3Dのレンダリングデータ：この方法は、3つのセクションに記載されています。 相関共焦点顕微鏡このセクションの目的は、相関、共焦点とSBEMイメージングを可能にする寸法の遠位結腸からの組織セグメントを収穫することです。次のようにプロトコルは次のとおりです。 1.収穫組織準備しますPBS中の50μg/ mlのヘパリン溶液10ml。 ケタミンの10ミリリットル（100 mg / mlの）とキシラジンの1ミリリットル（20 mg / mlの）を混合することにより、キシラジン/ケタミン麻酔在庫を準備します。 0.1MのPBSで4：1をキシラジン/ケタミンの株式を希釈します。 PBS中の4％パラホルムアルデヒドおよび0.1％グルタルアルデヒドを含む固定剤溶液100mlを準備します。 キシラジン/ケタミン麻酔薬の致死量で6〜10週齢PyyGFPマウスを、麻酔。マウス体重の20グラム当たり0.15ミリリットルで腹腔内麻酔薬を注入します。 尾や足の指をつまんで、適切なマウスの麻酔を確認し、乾燥を防ぐために、目に軟膏を使用しています。 心臓内固定剤10を灌流する可変流量蠕動ポンプを使用してください。外科用ハサミ（12センチの長さ）を使用する腸、心臓、および肺を露出させるために腹腔を開き切りました。狭パターン湾曲鉗子（13センチ長）との心を持ち、蠕動ポンプから翼状針（19 G）を挿入し、I左心室NTO。すぐに、春ストレートはさみ（長さ4ミリメートル）と右心房をカット。 1分間のヘパリン溶液で最初に2ml /分の速度で灌流し、その後15分間氷冷固定液溶液でマウスの尾が完全に剛性になるまで。 注：これは、腸粘膜に小血管の破裂を防ぐために遅い速度で灌流するために非常に重要です。血管の破裂は、組織の超微細構造を損なうことになります。灌流が適切である場合、肝臓は3〜5分以内に色が淡い有効にしてください。 小さなハサミを使用して腹腔を開き、遠位直腸に盲腸との接合部から結腸全体を切除。氷冷PBSで組織を配置します。 PBSに沈めながら、小さな春のはさみで腸間膜に沿ってコロンを切り開い。 2.組織セグメントを解剖し、固定メスを使用して、遠位結腸から約6小さな組織セグメント（2 平方ミリメートル） で切断しました。シートO上でこれを行いますF歯科用ワックス及びPBSの数滴中に沈め。 4℃で3時間固定液中で組織セグメントをポスト修正。 3.マイクロ解剖組織ブロック PBS中の5％低融点アガロースを調製し、45℃の水浴中に保ちます。 標準サイズのティッシュテックCryomoldように、小さなプラスチック容器を使用して、5％の低融点アガロースで組織セグメントを埋め込みます。 振動刃ミクロトームに包埋切片をマウントし、氷冷PBSでバッファトレイを埋めます。 0.8振幅と0.04ミリメートル/秒の速度で300μmの組織片をカットします。注：この時点で、組織片をアガロースから除去されます。 アガロースで300μmの組織片を再埋め込み、ビブラトームのブレードに垂直にミクロトームにマウント。 ビブラトームを用いて、50μmの厚さで組織片を切断します。注：最終的な組織ブロックは、約300μm幅×50μ​​mの厚さでなければなりません。これらのDimensionsは、腸内分泌細胞の厚さは15〜20ミクロンとneuropodの長さ30〜70 nmの間であることが示されたパイロット共焦点実験から最適化されています。電池の向きが組織ブロックの表面に平行である場合にはそのため、セル全体は、厚さ50μm、幅300μmの組織のブロック内に含まれる可能性があります。目的の組織および細胞タイプに応じて、これらの寸法を変え。 4℃でPBS中の組織ブロックを格納します。 4.共焦点イメージング 4,000：1でPBSにDAPIを希釈することにより核染色溶液を調製します。 5分間、DAPI核染色で組織ブロックをインキュベートします。注：DAPI染色は、共焦点とSBEM画像を相関させるために有用であるそれらの核によって区別個々の細胞を容易にします。 帯電したスライドガラス上にマウント組織ブロックは、PBSを数滴を追加し、カバースリップでそれらをカバーしています。 共焦点顕微鏡を使用して、ブロックを識別する興味のある無傷の絨毛およびPyyGFP細胞とSとzスタックに光学切片を得るためにそれらを画像化しました。 1μmの光学切片のzスタックを取得するために20X / 0.8ツァイスプランアポクロマート対物レンズを使用してください。 zスタックのために細胞の位置を決定するために、対象の細胞、および微分干渉コントラスト（DIC）を局在化するために、他のセルとの関係を決定するために488nmの内在性GFPを405 nmで（DAPI）のためにチャネルを使用しますルーメン。 1024ピクセル以上の画像解像度を使用します。 アガロース5.埋め込みブロック PBS中の4％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒドを含む固定液の10ミリリットルを準備します。 慎重に組織ブロックにダメージを与えることなく離れてガラススライドからカバースリップをスライドし、カバースリップの端にPBSを添加することにより、ガラススライドから組織ブロックを削除します。そして、1にスライドから組織ブロックを転送するために美術の絵筆を使用4％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒド固定剤を含む0.5ミリリットルのマイクロチューブ。 4℃でのポストフィックス組織ブロックO / N。 PBSに組織ブロックを転送します。そして、2枚のスライドガラスの間に、それらを挟んで5％低融点アガロースでフラットブロックを埋め込みます。 注：アガロースの薄層でブロックを埋め込み、染色の際に事後操作が容易になります。 広場にアガロースをカットし、上側のハンド側に切り込みを作ります。注：このステップは、後続のステップの配向を維持する必要があります。 さらに処理するまで4℃でPBS 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに保管ブロック。 シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（SBEM） このセクションでは、組織ブロックは、低倍率でSBEMを用いて調製し、画像化されます。ブロック面の調査画像は、目的の細胞を含む領域を識別するために、共焦点データと相関しています。地域一回識別され、組織は7ナノメートル/ピクセルと70nmのスライスの解像度で撮像されます。これが解決し、他の細胞小器官から大高密度コア分泌小胞を区別するのに十分でした。腸内分泌細胞では、小胞のこのタイプは、直径13で100から150nmの間で変化します。次のようにプロトコルは次のとおりです。 6.染色組織切片 PBSから組織を除去し、0.1Mカコジル酸緩衝液で3回、各5分、すすぎます。 細胞膜14のコントラストを向上させるために0.1 Mカコジル酸緩衝液に溶解した0.1％のタンニン酸で1時間染色ブロック。 公開されたプロトコル11に従って、その後の染色および組織の脱水を行います。 Deerinckらに続いて。プロトコルは、これらの溶液を調製する：1）1％（w / v）のthiocarbonhydrazide（THC）。 2）アスパラギン酸溶液をリード。 3）1％酢酸ウラニル、および4）オスミウムtetraoxyde /フェロシアン化カリウム（のOsO 4 / Kフェロシアン化）。 4％のOsO 4と2倍を混ぜますのOsO 4 / Kフェロシアン化を行うために1：1の比率で[10ミリリットルのH 2 OにKフェロシアン化し、0.86グラムのNaカコジル酸を0.3グラム] Kフェロシアン化ストック。注：アガロース中に包埋された組織は染色中の取り扱いを容易にしたが。慎重に、その後の樹脂の浸透のためのアガロースを除去します。 0.1 Mカコジル酸緩衝液中のサンプル三回、5分毎に、リンスした後、4℃で2時間、OsO4 / Kフェロシアン化溶液を用いて染色。 60℃でそれぞれ、超純水で5分間3回すすぎ、そして30分間TCHと染色。 RTで60分間、2％のOsO 4（なしKフェロシアン化）と超純水で3回、それぞれ5分間および汚れを洗い流します。超純水で再び3回、各5分洗浄します。 4℃で1％の酢酸ウラニルO / Nで染色。超純水で3回、各5分洗浄します。 60℃で30分間のリードアスパラギン酸で染色。超純水で3回、各5分洗浄します。 solutioですすぐことにより、組織を脱水エタノール濃度の増加に伴って、NS。 50％、75％、85％、95％、絶対100％エタノールで2回、各5分洗浄します。終わりに、プロピレンオキシドを用いて2回、10分毎にセクションをすすぎます。 樹脂7.浸潤と埋め込み組織切片商業avaialbleキットを用いて樹脂とブロックを潜入。エポン包埋キットを用いて樹脂に埋め込む組織。 48％のエポキシ樹脂の混合物を準備し、20％ミリリットルDDSA、30％ミリリットルNMA、および2％DMP30。 5分間激しく樹脂混合物を攪拌した後、気泡が表面に来ることができるように30分間真空中でミックスを置きます。 1のプロピレンオキシドと樹脂を混合：1の比率、激しく振ります。組織から最後の脱水すすぎを外し、プロピレンオキシドとの混合樹脂を追加します。回転子のO / Nでのサンプルと場所バイアルとキャップなしバイアルのままにします。次の日は、作りたてのエポン樹脂を追加し、回転装置で90分間混合します。 それらを挟んでできるだけ平坦樹脂中に埋め込みブロック互いに15に付着するのを防止するために、液体離型剤を用いて硬化されたガラススライドの間です。 ブロックが平坦に埋め込まれると、60℃でさらに48時間のブロックを治します。 ブロックを解放するために離れてスライドを引き出します。 8.取り付けとイメージングのための組織ブロックをトリミング解剖顕微鏡下で、ブロックをトリミングする前に、目的の細胞を含有する領域を同定する容易にするために、共焦点顕微鏡写真のものと樹脂に包埋組織ブロックの向きと一致しています。 手動ダウン〜500×500μmのブロック面に樹脂包埋ブロックをトリミング。 30分間導電性エポキシ、乾燥を含むピンのフラットブロックをマウントします。その後、60℃で、表面上に平らにブロックを置き、乾燥O / N。 コー​​ト銀コロイド液でブロック。 COを容易にするために、直角ブロックのスライスを確保するために、組織切片フラットを維持シリアルブロック面と共焦点顕微鏡写真をrrelating。 9. SBEM 画像SBEMシステムを備えた走査型電子顕微鏡を用いてブロック（E .G。、3View）。 組織の顔がブロックから出てくるまで〜2μm刻み、切断時に初期厚さのセクションを設定します。 ブロック全体の顔のsurver画像を取得。 フィジーソフトウェアを使用して、固定および16を染色中にサンプルの反りのための共通分母とアカウントを生成するために、両方のシリアルブロック面と共焦点顕微鏡写真の測定を行います。 共焦点画像の座標に分母を乗じてブロック面上の関心領域の位置を確認します。参考として、微絨毛、杯細胞、または固有層の位置のように、他の構造的特徴を使用してください。 で、目的の画像領域2.25 kVの高真空モードでは7nm /ピクセル（または15,147X倍率）。スライスの増分を設定してください70nm以下で。 生の16ビット.dm3形式でSBEMデータを収集します。 面分割のための10の最適化SBEM画像 SBEMイメージは、8ビットの.TIFFに生.dm3形式から変換します。 フィジー0.8ガウスぼかしフィルタを用いて画像を.TIFFフィルター。 元のサイズの25％に設定されたデータを縮小してセットを処理するのに必要なRAMメモリの量を最小限にするために.TIFFスタックとして保存します。 変換モードフィジーのプラグイン「SIFTと線形スタックアライメント」を使用してSBEM画像のスタックの位置を合わせ、「作物3D」プラグインを使用して切り取ら。注：トリミングをさらにセグメント化し、ボリュームレンダリングに必要なRAMメモリの量を低減するのに役立ちます。 3Dで描画データ 11.共焦点顕微鏡 「面」ツールのモードを上回る自動を使用して、Zスタックを再構築する。 図1D、RECを示しています絶対強度として0.126ミクロンで表面エリアの詳細、上の滑らかなオプションを使用して、各チャネルのonstruction、およびしきい値。 12.シリアルブロック面SEM 注：手動データセグメント化は非常に時間の手順を消費し、数週間かかることが手順を描画する機能に応じてです。 Bohórquez らに提示ビデオや数値のための分割。2014年8を手動で行われ、労働力の約500時間を要しました。これは、セグメント化プロセスを開始する前にレンダリングを必要とする基本的な機能に優先順位を付けることをお勧めします。手順は次のとおりです。 手動セグメントに50ミリ秒の描画モードで描画モードと「輪郭」オプションで「面」ツールを使用し、ボリュームが目的の細胞をレンダリング。 スムーズなレンダリングまたはより高速なレンダリングのために、すべての5つのスライスにセルのすべてのスライス上の輪郭をトレースします。 エクスポート最終イム300dpiの以上の解像度で「スナップショット」ツールを使用して年齢。