JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

מתאם Confocal ו3D מיקרוסקופית אלקטרונים של תא חושי ספציפי

Published: July 19, 2015
doi:
10.3791/52918
, , ,
1Department of Medicine,Duke University Medical Center, 2Department of Chemistry,University of North Carolina – Chapel Hill, 3Renovo Neural Incorporated

Summary

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Abstract

תיחום של ultrastructure של תאים חשוב להבנת תפקודו. זה יכול להיות פרויקט מרתיע לסוגי תאים נדירים מתפזרים בכל רקמות עשויות סוגי תאים שונים, כגון תאי enteroendocrine של האפיתל המעיים. חיישנים אלה במערכת העיכול של מזון וחיידקים היו קשים ללמוד כי הם התפזרו בין תאי האפיתל אחרים ביחס של 1: 1,000. לאחרונה, עכברים מהונדסים כתב כבר נוצר כדי לזהות תאי enteroendocrine באמצעות הקרינה. אחד מאלה הוא עכבר YY-GFP פפטיד. שימוש בעכבר זה, פיתחנו שיטה כדי לתאם confocal ומיקרוסקופ אלקטרונים סורקים בלוק פנים סידורי. אנחנו בשם השיטה cocem3D ומיושמים בו כדי לזהות תאי enteroendocrine ספציפיים ברקמות ולחשוף ultrastructure של התא ב3D. הרזולוציה של cocem3D מספיק כדי לזהות אברונים קטנים כמו שלפוחית ​​הפרשה ולהבחין קרום תא לאחסון מחדשndering. Cocem3D ניתן להתאים בקלות ללמוד את ultrastructure 3D של סוגי תאים אחרים ספציפיים ברקמות האם שלהם.

Introduction

חיים בתוך תא מתרחשים בזמן ובמרחב. שינויים לאורך הזמן לעתים קרובות למדו באמצעות מיקרוסקופ הזמן לשגות בשילוב עם טכניקות הדמיה הקרינה, כמו מיקרוסקופ ברזולוציה סופר. שטח, בפרט ההסדר של האברונים בתוך תא או אינטראקציות תא אל התא, ניתן לגזור רק על ידי חשבון של המבנה העדין של התאים שלם. חשבון מקיף של המבנה העדין של תאים יכול גם להביא בהירות לפונקציה הגנומי במקרים בהם הגנום הוא זמין, כמו ג נמטודות elegans 1 או tricoplax placozoa השטוח adherens 2. מיקרוסקופ אלקטרונים חתך סידורי הוא החברה לשחזור, זמן יעיל, ומשימה הודות פחות יקרה לפיתוח טכנולוגיות במיקרוסקופ האלקטרונים 3D האוטומטי, כמו מיקרוסקופ בלוק פנים סידוריים אלקטרונים הסורקים 3 (SBEM).

הצורך במידע מבני על מנת להבהיר פונקציה הוא מאוד ברור בcel מסויםסוגי l בי פונקציה תלויה באינטראקציות תא אל התא פיזיים, כגון תאי עצב, גליה, או תאי אפיתל חושיים. אנחנו מעוניינים בעיקר בהבהרה כיצד אותות חושיים מחומרים מזינים בלומן של המעיים transduced לאות חשמלי שסופו של הדבר מודולציה התנהגויות תיאבון. המעגל הוא מורכב, אך מתחיל בקיר של המעי בי חומרים מזינים באים במגע עם תאי אפיתל חושיים, תאי enteroendocrine נקראים. שלא כמו תאים אחרים חושיים אפיתל, כגון תאי טעם, תאי enteroendocrine פזורים ברחבי אפיתל מעי ביחס של 1-1000 4-7. כתוצאה מכך, הם היו קשים לזהות וללמוד, ובמשך זמן רב הם נתפסו רק כמקור של הורמוני בטן. אבל עם ההתפתחות של עכברי כתב הקרינה תא ספציפי, התפקוד החושי המורכב של תאים אלה מתפתח. באמצעות אחת מהעכברים כתב אלה, YY-GFP עכבר פפטיד (PyyGFP), מצאנו enteroendocr שיש תאי ine זנב cytoplasmic בולט ששם neuropod. המראה של neuropods הציע פונקצית שימור בתקשורת תא אל התא. לפיכך, אנו מנומקים שעל ידי המתעדים את ultrastructure של תא enteroendocrine, הפונקציה של neuropods יכולה לנבוע.

הצורך להבין את המבנה של תוספת בתא מפוזר שקשה לזהות היה הרציונל העיקרי לפיתוח שיטה לשלב מיקרוסקופיה confocal וSBEM. התא של העניין זוהה באמצעות עכברי כתב התא ספציפי enteroendocrine PyyGFP. השיטה מאפשרת לנו לתעד את כל ultrastructure של תא enteroendocrine וneuropod. בתוך neuropods, מצאנו תכונות מבניות של אקסונים עצביים, ומחוץ neuropods, מצאנו קשר פיזי לגליה מעיים 8. ואכן, neuropods מכיל כ -70% מכלל המצביעה על שלפוחית ​​הפרשת תפקיד חיוני בתפקוד ההפרשה של תאים אלה. בנייה בנתונים מבניים, ולאחרונה מצאנו כי באמצעות neuropods אלה, תאי enteroendocrine והנוירונים innervating הבטן יוצרת מעגל neuroepithelial, דומה לזו של תאי טעם בלשון 8,9.

חשיפת תכונות כגון מנגנוני chemosensory עיכול נבעו מנתונים שנאספה מבניים בשיטה מיקרוסקופית מתאם זה. אנו מאמינים בשיטה זו יכולה להיות שימושית בתחומים אחרים של ביולוגיה של תא, במיוחד שבו תאים מפוזרים בתוך הרקמות ביחס נמוך מאוד. אנחנו התייחסנו לשיטה כconfocal הגומל ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק פנים בלוק סידורי ב3D (Cocem3D). השיטה מורכבת מהשלבים העיקריים הבאים: נתיחת רקמה, מיקרוסקופיה confocal, הדמיה SBEM, SBEM ומתאם תמונת confocal, ופילוח ידני. בהשוואה לשיטות אחרות גומלות, הרעיון הוא פשוט למדי, כי המתאם הוא פיזי ולא כימי.

Protocol

כל הטיפול בבעלי החיים והניסויים נעשו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת דיוק. Cocem3D נבע משילוב של פרוטוקולים שפורסמו בעבר 10,11 ויושם כאן כדי ללמוד תא enteroendocrine ספציפי באמצעות עכבר כתב PyyGFP 12. שיטה זו בקלות יכולה להיות מיושמת על תאים אחרים של עניין באמצעות עכברים מהונדסים כתב זמינים מסחרי. השיטה מתוארת בשלושה חלקים: מיקרוסקופיה הגומלת confocal, מיקרוסקופיה בלוק פנים סידורי אלקטרונים סורקים (SBEM), ונתוני עיבוד ב3D. מתאם מיקרוסקופיה confocal מטרת סעיף זה היא לקצור קטע רקמה מהמעי גס דיסטלי של ממדים המאפשרים confocal גומל והדמיה SBEM. הפרוטוקול הוא כדלקמן: 1. קציר רקמות הכן10 מיליליטר של 50 מיקרוגרם פתרון / הפרין מיליליטר PBS. הכן מניית ההרדמה xylazine / קטמין על ידי ערבוב 10 מיליליטר של קטמין (100 מ"ג / מיליליטר) ו 1 מיליליטר של xylazine (20 מ"ג / מיליליטר). לדלל xylazine / מניות קטמין 1: 4 ב0.1M PBS. הכן של פתרון מקבע מכיל paraformaldehyde 4% וglutaraldehyde 0.1% ב PBS 100 מיליליטר. הרדימי עכבר PyyGFP, 6 עד 10 שבועות, עם מנה קטלנית של חומר ההרדמה xylazine / קטמין. להזריק את חומר ההרדמה intraperitoneally ב0.15 מיליליטר לכל 20 גרם של משקל עכבר. לאשר הרדמה עכבר נכונה על ידי צובט את הזנב או רגליים, ולהשתמש במשחה על עיניים כדי למנוע יובש. השתמש משאבת peristaltic זרימה משתנה לperfuse מקבע intracardially 10. בעזרת מספריים כירורגית לחתוך (אורך סנטימטר 13) לפתוח את חלל הבטן לחשוף את המעיים, לב והריאות. מחזיק את הלב עם מלקחיים צר-דפוס מעוקל (אורך 12 סנטימטרים) ולהכניס מחט פרפר (19 G) ממשאבת peristaltic אניn כדי עזב חדר. מייד, לחתוך אטריום ימין עם מספריים באביב ישר (אורך 4 מ"מ). Perfuse בשיעור של 2 מיליליטר / דקה ראשונה עם פתרון הפרין דקות 1, ולאחר מכן עם פתרון מקבע קר כקרח במשך 15 דקות עד שהזנב של העכבר היא קשיחה לחלוטין. הערה: חשוב מאוד לינקבו בקצב איטי כדי למנוע התפוצצות של כלי דם קטנים ברירית המעי. התפוצצות כלי תתפשר ultrastructure של הרקמה. אם זלוף הוא נאות, הכבד צריך להפוך חיוור בצבע בתוך 3-5 דקות. מספריים קטנים באמצעות לפתוח את חלל הבטן ובלו המעי הגס כולו מהצומת עם cecum לרקטום דיסטלי. הנח את הרקמה בPBS קר כקרח. תוך שקוע בPBS, לחתוך פתוח עם מספריים באביב קטנים המעי הגס לאורך לפדר. 2. הביתור ותיקון רקמות מגזרים באמצעות אזמל, לחתוך כ -6 מקטעים קטנים רקמה (2 מ"מ 2) מהמעי גס דיסטלי. לעשות את זה על o גיליוןשעוות f שיניים ושקועה בכמה טיפות של PBS. פוסט לתקן את קטעי הרקמה בפתרון מקבע עבור 3 שעות ב 4 ° C. 3. בלוקים רקמות מיקרו לנתח הכן 5% נמוך היתוך agarose ב PBS ולשמור אותו באמבט מים ב 45 ° C. להטביע קטעי הרקמה ב5% נמוכים היתוך agarose באמצעות מיכל פלסטיק קטן, כמו הגודל הסטנדרטי רקמות-Tek cryomold. הר הסעיפים המוטבעים על microtome להב רוטט ולמלא את מגש החיץ עם PBS קר כקרח. חותך 300 מיקרומטר רצועות רקמה על 0.8 משרעת ומהירות / sec 0.04 מ"מ. הערה: בשלב זה, את רצועות הרקמה תהיה חלצה מן agarose. 300 רצועות רקמת מיקרומטר בagarose ולעלות אותם על microtome בניצב ללהב של vibratome-להטביע מחדש. באמצעות vibratome, לחתוך רצועות רקמה בעובי של 50 מיקרומטר. הערה: בלוקים הרקמה הסופיים צריכים להיות בערך 300 מיקרומטר x הרחב 50 מיקרומטר עבים. ד אלוimensions מותאם מניסויי confocal הטייס שהראו כי העובי של תא enteroendocrine הוא בין 15-20 מיקרומטר וננומטר 30-70 האורך של neuropod. לכן, כל תא יכול להיות בתוך גוש של רקמה 300 מיקרומטר רחב ב -50 מיקרומטר עבה אם הנטייה של התא היא במקביל לפנייה של גוש הרקמה. להשתנות ממדים אלה בהתאם לסוג הרקמה ותא של עניין. אחסן את לוקי רקמת PBS ב 4 מעלות צלזיוס. 4. Confocal הדמיה הכן פתרון כתם גרעיני על ידי דילול DAPI ב PBS 1: 4,000. דגירה בלוקים רקמות בכתם גרעיני DAPI במשך 5 דקות. הערה: מכתים DAPI מאפשר תאים בודדים הבחנה על ידי הגרעינים שלהם, שהוא מועיל למקשר תמונות confocal וSBEM. בלוקים רקמת הר בטעונים שקופיות זכוכית, להוסיף כמה טיפות של PBS, ולכסות אותם עם coverslip. באמצעות מיקרוסקופ confocal, לזהות בלוקים עם villi שלם ותאי PyyGFP של עניין וצלם אותם כדי להשיג Z- ערימות חלקים אופטיים. השתמש אובייקטיבי Zeiss תכנית Apochromat 20X / 0.8 להשיג Z- ערימות של 1 מיקרומטר סעיפים אופטיים. לZ- המחסנית, להשתמש בערוצים ל405 ננומטר (DAPI) כדי לקבוע את מערכת היחסים לתאים אחרים, 488 GFP אנדוגני ננומטר למקם את התא של עניין, והתערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) כדי לקבוע את מיקום של התא ביחס ל לומן. השתמש רזולוציית תמונה של 1,024 פיקסלים ומעלה. 5. הטבעה בלוקים בAgarose הכן 10 מיליליטר של מקבע מכיל paraformaldehyde 4% וglutaraldehyde 2.5% ב- PBS. הסר את קוביות רקמה משקופיות הזכוכית על ידי הוספת PBS בזהירות בקצוות של להחליק את המכסה כדי להחליק את coverslip משקופיות הזכוכית מבלי לפגוע ברקמת הבלוק. לאחר מכן, השתמש במכחול אמנות להעביר את גוש הרקמה מהשקופית ל1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge המכיל paraformaldehyde 4% ו -2.5% מקבע glutaraldehyde. בלוקים פוסט לתקן רקמות O / N ב 4 מעלות צלזיוס. העבר בלוקים רקמות לPBS. לאחר מכן, להטביע בלוקים שטוחים ב 5% נמוכים היתוך agarose ידי הרבדה אותם בין שתי שקופיות זכוכית. הערה: Embedding הלוקים בשכבה דקה של agarose מקלה מניפולציה אחורית במהלך צביעה. חותך את agarose בכיכר ולעשות חריץ בצד העליון. הערה: שלב זה הוא הכרחי כדי לשמור על ההתמצאות בשלבים הבאים. בלוקים חנות בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם PBS על 4 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף. סידורי סריקת בלוק פנים מיקרוסקופית אלקטרונים (SBEM) בסעיף זה, בלוק הרקמה מוכן וצלם עם SBEM בהגדלה נמוכה. תמונת הסקר של הפנים הבלוק אז מתואם עם נתוני confocal לזהות האזור המכיל את התא של עניין. ברגע שהאזורמזוהה, הרקמה היא הדמיה ברזולוציה של 7 ננומטר / פיקסל ופרוסות של 70 ננומטר. זה היה מספיק כדי לפתור ולהבחין שלפוחית ​​הפרשת ליבה גדולה צפופה מאברונים אחרים. בתאי enteroendocrine, זה סוג של שלפוחית ​​משתנה בין 100 ל -150 ננומטר בקוטר 13. הפרוטוקול הוא כדלקמן: 6. סעיפים רקמות מכתים הסרה של הרקמה מPBS ולשטוף שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, במאגר M 0.1 cacodylate. בלוקים כתם לשעה 1 ב0.1% חומצה טאני מומסים במאגר M 0.1 cacodylate כדי לשפר את הניגודיות של קרום תא 14. לבצע צביעה והתייבשות של רקמות לאחר בהתאם לפרוטוקול שפורסם 11. בעקבות Deerinck et al. פרוטוקול, להכין פתרונות הבאים: 1) 1% (w / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) להוביל פתרון aspartate; 3) אצטט uranyl 1%, ו -4) ferrocyanide tetraoxyde אוסמיום / אשלגן (OSO 4 / K ferrocyanide). לערבב 4% 4 OSO ו2xמניית K ferrocyanide [0.3g K ferrocyanide ו0.86g Na Cacodylate ב 10 H מיליליטר 2 O] ב 1: 1 יחס לעשות OSO 4 / K ferrocyanide. הערה: לאחר הרקמה המשובצת בagarose מאפשר טיפול בכתמים. מוציא בזהירות agarose לחדירת שרף שלאחר מכן. דגימות שטיפה שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, במאגר M 0.1 cacodylate ואז כתם עם פתרון OsO4 / K ferrocyanide לשעה 2 ב 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף במים טהורים פעמים אולטרה שלוש, 5 דקות כל אחד, ואת כתם עם TCH למשך 30 דקות ב -60 מעלות צלזיוס. יש לשטוף במים טהורים במיוחד שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד וכתם עם 2% 4 OSO (לא K ferrocyanide) במשך 60 דקות ב RT. יש לשטוף שוב במים טהורים במיוחד שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד. כתם עם 1% O אצטט uranyl / N ב 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף במים טהורים במיוחד שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד. כתם עם aspartate להוביל למשך 30 דקות ב -60 מעלות צלזיוס. יש לשטוף במים טהורים במיוחד שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד. מייבשים רקמות על ידי השטיפה בsolutioNS עם הגדלת ריכוזים של אתנול. לשטוף 2 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 50%, 75%, 85%, 95%, ואתנול 100% מוחלטים. בסוף, לשטוף חלקים עם פרופילן אוקסיד שתי פעמים, 10 דקות כל אחד. 7. חלקי רקמות הסתננות והטבעה בשרף לחדור בלוקים עם שרף באמצעות הערכה המסחרית avaialble. רקמות להטביע בשרף באמצעות ערכת הטבעת EPON. להכין תערובת שרף אפוקסי של 48%, 20% מיליליטר DDSA, 30% מיליליטר NMA, ו -2% DMP30. להתסיס תערובת שרף מרץ במשך 5 דקות ולאחר מכן למקם תערובת בואקום במשך 30 דקות כדי לאפשר בועות כדי לעלות אל פני השטח. לערבב שרף עם פרופילן אוקסיד ביחס של 1: 1 ולנער במרץ. הסר את שטיפת ההתייבשות הסופית מרקמות, ולהוסיף שרף מעורב עם פרופילן אוקסיד. בקבוקון מקום עם דגימות בO מסובבי / N ולהשאיר הסיר את מכסת בקבוקון. למחרת, להוסיף שרף EPON טרי ולערבב למשך 90 דקות על כתף. בלוקים להטביע בשרף שטוח ככל האפשר על ידי הרבדה אותם בבין שקופיות זכוכית שנרפאו עם סוכן שחרור נוזלים כדי למנוע מהם להידבק זה לזה 15 אחרים. ברגע שחוסם מוטבעים שטוח, לרפא את הלוקים לשעה בנוסף 48 על 60 מעלות צלזיוס. משוך שקופיות מלבד לשחרר בלוקים. 8. התקנה וזמירת בלוק רקמות הדמיה תחת בהיקף לנתח, שיתאים לכיוון של בלוקים הרקמות משובצים בשרף עם זה של micrographs confocal כדי להקל על זיהוי האזורים המכילים את התאים של עניין לפני זמירה הבלוק. חתוך את הבלוק משובץ השרף ידני עד ~ 500 x 500 בלוק פנים מיקרומטר. הר הבלוק שטוח על סיכה המכילה אפוקסי ויבש מוליך למשך 30 דקות. לאחר מכן, להניח את הגוש שטוח על משטח וO היבש / N ב 60 ° C. מעיל הבלוק עם נוזל מי כסף. לשמור על סעיפי רקמות שטוחים כדי להבטיח חיתוך של הבלוק בזווית נכונה כדי להקל על שיתוףrrelating micrographs בלוק פנים וconfocal הסידורי. 9. SBEM תמונה לחסום באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מצוידים במערכת SBEM (ה .g., 3View). סעיף להגדיר ראשוני עובי ב ~ 2 מיקרומטר מרווחים ולחתוך עד הפנים של רקמה עולה מהבלוק. לרכוש תמונת surver של כל הפנים הבלוק. שימוש בתוכנת פיג'י, לקחת מידות של micrographs שני בלוק פנים וconfocal הסידוריים כדי ליצור מכנה משותף וחשבון להשתאה מדגם במהלך קיבעון ומכתים 16. אתר את האזור של עניין על פני הבלוק על ידי הכפלת המכנה לקואורדינטות בתמונות confocal. השתמש גם תכונות מבניות אחרות, כמו המיקום של microvilli, תאי גביע, או propria lamina, כנקודת התייחסות. אזור תמונה של ריבית ב2.25 ק ו -7 ננומטר / פיקסל (או הגדלת 15,147X) במצב ואקום גבוה. יש להגדיר מרווחי Sliceב 70 ננומטר או פחות. לאסוף נתונים SBEM בפורמט .dm3 16 סיביות גלם. תמונות 10. אופטימיזציה SBEM לפילוח Surface המרת תמונות SBEM מתבנית .dm3 גלם ל.tiff 8 סיביות. סנן .tiff תמונות באמצעות מסנן 0.8 Gaussian לטשטש בפיג'י. להקטין את הנתונים להגדיר עד 25% מהגודל המקורי ולשמור אותו כערימת .tiff כדי למזער את כמות זיכרון RAM צורך לטפל במכשיר. יישר את ערימת תמונות SBEM באמצעות תוסף פיג'י "יישור מחסנית ליניארי עם לנפות" במצב תרגום וייחתך באמצעות התוסף "יבול 3D". הערה: חיתוך עוזר להפחית עוד יותר את כמות זיכרון RAM הדרושה לפילוח ונפח טיוח. עיבוד נתונים ב3D 11. Confocal מיקרוסקופית לשחזר Z- ערימות באמצעות אוטומטי לעלות מצב של כלי "משטחים". איור 1D, תערוכות reconstruction של כל ערוץ באמצעות האפשרות החלקה ב, פרט אזור משטחים ב0.126 מיקרומטר, וthresholding כעוצמת מוחלטת. 12.-בלוק פנים סידוריים SEM הערה: פילוח נתונים ידני הוא מאוד זמן רב והליך בהתאם לתכונות שהפכו את ההליך יכול להימשך מספר שבועות. פילוח לקטעי הווידאו והנתונים שהוצגו באל Bohórquez et. 2,014 8 נעשה באופן ידני ולקח כ -500 שעות של עבודה. מומלץ לתעדף את התכונות החיוניות צורך טיוח לפני תחילת תהליך הפילוח. ההליך הוא כדלקמן: השתמש בכלי "משטחים" בתיקו מצב ואת האפשרות "גובה" בציור המצב של 50 אלפיות שניות למגזר ידני ונפח שניתנו התא של עניין. עקוב אחר קווי המתאר בכל פרוסה של התא לעיבוד חלק או כל 5 פרוסות לעיבוד מהיר יותר. im הסופי היצואגילאי שימוש באפשרות "תמונת המצב" ברזולוציה של 300 dpi או יותר.

Representative Results

השיטה המוצגת כאן שימשה ללמוד ultrastructure של תאים ספציפיים בתוך שכבה של האפיתל. התא של עניין במקרה זה הוא תא enteroendocrine החמקמק. זיהוי שלהם באתר היה אפשרי רק בשנים האחרונות עם ההתפתחות של עכברי כתב הקרינה סלולריים ספציפית. בשנת 2011, פיתחנו עכבר שבי האמרגן של PYY ההורמון מניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק 17. בPyyGFP עכבר זה, תאי enteroendocrine של החלק הדיסטלי של המעי דק ומעי גס נבדלים בקלות תחת אור UV. מודל עכבר זה היה בסיס לזהות גוש רקמה המכיל תאי enteroendocrine ולעבד אותו לSBEM. שיטת המתאם נקראת כאן כcocem3D ונבנתה על פרוטוקולים שפורסמו בעבר 10,11. אופטימיזציה של הממדים של גוש הרקמה היא קריטית למתאם. בניסויים ראשוניים,נקבע כי בגוש רקמה 300 מיקרומטר x הארוך 50 מיקרומטר עבים מספר תמונות SBEM מצטמצם למינימום ואילו המכסים את כל הגוף של התא של עניין. איור 1 א מציג תצפית על הנתיחה באמצעות microtrome להב רוטט ל להשיג בלוק הרקמה עם הממדים הנכונים. לפחות 100 בלוקים מתקבלים לפני המיון דרכם לאסוף אותם עם תאים שלמים של עניין. בלוקים נבחרים הם צילמו על ידי מיקרוסקופ ותמונת confocal Z- ערימות הם אופטיים במרווחים כל מיקרומטר (איור 1 ו- C) 1. 1D איור מציג תצוגה שניתנו נפח תא enteroendocrine במעי של העכבר. neuropod הבולט שלה משתרע מתחת לתאי האפיתל ל~ 60 מיקרומטר. התא של עניין נמצא על ידי מקשר Z- ערימות confocal עם תמונת SBEM של כל הפנים הבלוק. דוגמא מוצגת כאן של בלוק מהמעי גס דיסטלי של PyyGFPעכבר. לאחר קבלת Z- ערימות confocal (איור 2 א), הבלוק משובץ בשכבה דקה של agarose התכה נמוכה (איור 2). זה הכרחי למניפולציה הבאה של הבלוק. זה חשוב לשמור על הכיוון של הבלוק השטוח ככל האפשר כדי להתאים את הפרוסות אופטיות עם פרוסות SBEM. באיור 2 ג, תמונת נציג מוצגת בכל הפנים של בלוק הרקמה. חלקים של נתון זה פורסמו בעבר באל Bohorquez et. 2014 8. זה היה מתואם לאחר מכן עם תמונת confocal על ידי לקיחה בחשבון ציוני דרך רקמה וממדים. איור 2 ד מציג כיסוי של confocal ותמונת SBEM של הבלוק, חושף מיקום מדויק של התא של עניין שלנו. ברגע שהתא זוהה, ההדמיה SBEM נעשה ברזולוציה גבוהה מספיק כדי לזהות שלפוחית ​​הפרשה ואברונים תאים אחרים. סט הנתונים שהוצג לומחדש היה צילם בשעה 7 ננומטר לכל פיקסל כתמונות של הבלוק נלקחו כל ננומטר 70. נתונים להגדיר הכילו 643 תמונות שמשתרעות על פני 45 מיקרומטר לעומק הרקמה. כמה מיקרונים מגולחים במהלך הדמיה ראשונית של כל הפנים הבלוק בהגדלה נמוכה. סט נתונים SBEM הגלם נרכש ב.dm3 פורמט והפך ל.tiff לטיפול שלאחר מכן. ערימת SBEM הייתה קצוצה באמצעות תוכנת פיג'י תוסף "יבול (3D)" בלוק להכיל רק את האזור של עניין. פעולה זו מפחיתה את כמות זיכרון RAM הדרוש לנפח טיוח. התא זוהה על ידי עמדתה ושלפוחית ​​הפרשה, ומפולח באמצעות תוכנת Imaris. איור 3 מכיל טיוח ב3D של תא enteroendocrine. איור 1:. מיקרוסקופיה confocal מתאם () Workflow לנתח פיסתרקמת מעי לרקמה לחסום 300 x 50 מיקרומטר עבה. בלוק רקמת נציג הממדים הנכונים (B). שים לב שגוש רקמה של ממדים אלה מהמעי דק העכבר משתרע villi על 3 או, במקרה של המעי הגס על 8 מאורות. סיסי (ג) במעי הדק המכיל תא של עניין. (ד) Z- מחסנית confocal שניתנו ב3D באמצעות תוכנת Imaris תערוכות תא enteroendocrine עם neuropod בולט פועל מתחת לאפיתל במעי. כחול = DAPI כתם גרעיני. ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוק פנים סידורי (א) תמונת Confocal של Sele גודל.בלוק רקמת cted מהמעי הגס המכיל תאי enteroendocrine PyyGFP (ירוק) של עניין. (ב) ברגע שהבלוק הוא הדמיה על ידי מיקרוסקופ confocal, זה מוטבע אז שטוח בהתכה נמוכה agarose באמצעות שקופיות זכוכית. הטבעת גוש הרקמה בagarose מאפשרת מניפולציה שלאחר מכן, ואת החריץ בפינה השמאלית עוזר לעלות הבלוק בתוך SBEM בכיוון הנכון. (ג) SBEM תמונה של הפנים של הבלוק. מתאם (D) של נתוני confocal עם SBEM לזהות תא של העניין (חץ לבן). תמונות בC ו- D של נתון זה משתנות מBohorquez et al., 2014 8. כחול = גרעיני כתם DAPI. ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <br /> איור 3:. נתונים טיוח ב3D () טיוח נפח של תא enteroendocrine באמצעות תוכנת Imaris. התא מכיל neuropod ארוז עם שלפוחית ​​הפרשה. לתיאור ultrastructure של תא enteroendocrine מלא, עיין Bohórquez et al., 2014 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

chemosensation עיכול מתגלה כתחום חדש ומלהיב במחקר הביו-רפואי. זה בחלק גדול בשל הגילוי של קולטני טעם תפקודי בתאי enteroendocrine 18. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי תאי enteroendocrine לבטא קולטנים ספציפיים לחומרים מזינים, כולל פחמימות, שומנים, וaminoacids 5,6,19,20. גורם קטליטי לתגליות אלה היה הפיתוח של עכברי כתב, שבו תאי enteroendocrine מסומנים 20 fluorescently. פיתחנו אחד מעכברים אלה, עכבר PyyGFP, ללמוד תאי enteroendocrine של המעי הדק והמעי גס דיסטלי 17,21. תאים אלה הם עניין כי הם מפרישים PYY ופפטיד כמו גלוקגון -1, אשר שניהם מעוררי שובע 22,23. באותו הזמן, חשבון אולטרה-מבני מלא של תאים אלה היה חסרים, שהאמנו היה חיוני כדי להבין את מנגנוני האיתות שלהם.

ontent "> כאן, שתארנו באופן חזותי שיטה לגשר מיקרוסקופיה confocal עם SBEM. השיטה נקראת כCocem3D, אשר אפשר לנו לתעד את ultrastructure של תאי enteroendocrine המלא. יש לנו דיווח שיש תאים אלה neuropod המכיל שלושה רבעים של כל שלפוחית ​​הפרשת 8. בתוך neuropod, יש neurofilaments והרבה כמו אקסונים עצביים, neuropods הם טיפחו על ידי תאי גליה מעיים 8. חשוב מכך, הוא אף neuropods אלה שenteroendocrine תאים להתחבר פיזי לתאי עצב innervating המעי ו מעי גס 9.

אחת מנקודתי החוזק של cocem3D הוא בפשטותו. הפחתת דגימת הרקמה לגוש שניתן הדמיה על ידי confocal וSBEM מאפשר זיהוי של תאים ספציפיים בתוך רקמה. שלפוחית ​​הפרשה ואברונים אחרים ניתן לזהות בקלות ברזולוציה של 7 ננומטר / פיקסל. עיבוד בגלל הסעיפים בSBEM מבוטלים, נוסףלשיר של רקמות לזיהוי חלבונים ספציפיים הוא לא אופציה בשלב זה. עם זאת, הפיתוח של שיטות כגון 24 ATUM, שבחלקים מגוש הרקמה נשמרים, עשויים לאפשר זיהוי של חלבונים ספציפיים בתא. קביעת המיקום הספציפי של קולטנים chemosensory על תאי enteroendocrine היא מידע חיוני לפיתוח טיפולים התרופתיים להשמנת יתר, משום שתאי enteroendocrine הם ממשק חושי בין מזון במעיים והשובע במוח.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Bohórquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

Materials

Phosphate buffered saline Life technologies 10010023
Heparin sodium salt Sigma H4784
Paraformaldehyde  Sigma 158127 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4
Glutaraldehyde Sigma G5882
Dental wax Electron Microscopy Sciences 72660
Low-melting agarose Life technologies 16520-100 5%, freshly made in PBS
Standard Tissue-Tek Cryomold Electron Microscopy Sciences 62534-25
DAPI  nuclear stain Life technologies D1306
Postively charged glass slides and coverslips
Fine art paintbrush #1
Cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 11650
Tannic acid Electron Microscopy Sciences 21700
EMbed 812 kit  Electron Microscopy Sciences 14120
Liquid releasing agent  Electron Microscopy Sciences 70880
Liquid silver colloidal    Electron Microscopy Sciences 12630
CircuitWorks conductive epoxy   ITW Chemtronics CW2400
Variable flow peristaltic pump VWR 70730-064
VT1200S Vibrating blade microtome Leica
Zeiss 780i confocal microscope Carl Zeiss 
Sigma VP Scanning Electron Microscope  Carl Zeiss 
3view system Gatan
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) http://www.renovoneural.com Renovo provides 3d EM services
Fiji software Open access software
Computer station with 16GB of RAM or more
Data visualization software Imaris 7.5  Bitplane
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
  2. Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
  3. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329 (2004).
  4. Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
  5. Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
  7. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
  8. Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881 (2014).
  9. Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. , (2015).
  10. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
  11. Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. . NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).
  12. Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
  13. Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
  14. Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
  15. Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  17. Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
  18. Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
  19. Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
  22. Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
  23. Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
  24. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).

Tags

Correlative MicroscopyConfocal Microscopy3D Electron MicroscopyEnteroendocrine CellsIntestinal EpitheliumTransgenic Reporter MicePeptide YY-GFPUltrastructureVolume Rendering

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bohórquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J. Vis. Exp. (101), e52918, doi:10.3791/52918 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image