Korrelat konfokale und 3D-Elektronenmikroskopie eines spezifischen Sinneszelle

Alle Tierpflege und Experimente wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll, das von der Duke University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt wurde. Cocem3D stammten aus einer Kombination der zuvor veröffentlichten Protokollen 10,11 und wurde hier angewendet, um eine bestimmte enteroendokrine Zelle unter Verwendung eines Reporter PyyGFP Maus 12 zu studieren. Dieses Verfahren kann leicht auf andere Zellen von Interesse unter Verwendung von kommerziell erhältlichen transgenen Mäuse Reportergen angewendet werden. Correlative Konfokalmikroskopie serielle Block-face Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) und Datendarstellung in 3D: Das Verfahren wird in drei Abschnitten beschrieben. Korrelat konfokale Mikroskopie Das Ziel dieses Abschnitts ist es, eine Gewebesegments aus dem distalen Kolon von Dimensionen, die korrelative konfokale Bildgebung SBEM ermöglichen ernten. Das Protokoll ist wie folgt: 1. Ernten der Tissue Bereiten10 ml von 50 ug / ml Heparinlösung in PBS. Vorbereitung Xylazin / Ketamin Narkose Lager durch Mischen von 10 ml Ketamin (100 mg / ml) und 1 ml Xylazin (20 mg / ml). Verdünnen Xylazin / Ketamin Lager 1: 4 in 0,1 M PBS. Bereiten Sie eine 100 ml Fixierlösung mit 4% Paraformaldehyd und 0,1% Glutaraldehyd in PBS. Betäuben eine PyyGFP Maus, 6 bis 10 Wochen alt, mit einer letalen Dosis von Xylazin / Ketamin-Narkose. Spritzen Sie die Narkose intraperitoneal mit 0,15 ml pro 20 g Mausgewicht. Bestätigen Sie die richtige Maus Betäubung durch Einklemmen des Schwanzes oder Zehen, und verwenden Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit zu verhindern. Verwenden Sie eine variable Strömungs peristaltische Pumpe zu Fixiermittel intrakardial 10 durchströmen. Verwendung chirurgische Scheren (13 cm Länge) geschnitten öffnen Sie die Bauchhöhle, den Darm, Herz und Lunge aus. Halten Sie Herz mit Schmal Muster gebogenen Pinzette (12 cm Länge), und setzen Schmetterlingsnadel (19 G) aus Schlauchpumpe into linken Ventrikels. Unmittelbar, schneiden rechten Vorhof mit Feder geraden Schere (Länge 4 mm). Perfusion mit einer Geschwindigkeit von 2 ml / min zunächst mit Heparin-Lösung für 1 min, und dann mit eiskaltem Fixierungslösung für 15 Minuten, bis der Maus den Schwanz ist völlig starr. Anmerkung: Es ist sehr wichtig, um bei einer langsamen Rate zum Bersten der kleinen Gefäße in der Darmschleimhaut verhindert perfundieren. Platzen der Schiffe wird Ultrastruktur des Gewebes beeinträchtigen. Wenn Perfusion angemessen ist, die Leber sollte blass in der Farbe innerhalb 3-5 min drehen. Mit Hilfe einer kleinen Schere öffnen Sie die Bauchhöhle und der Verbrauch den gesamten Dickdarm von der Kreuzung mit der Blinddarm zum distalen Rektum. Legen Sie das Gewebe in eiskaltem PBS. Während in PBS eingetaucht, aufgeschnitten mit kleinen Feder Schere den Doppelpunkt entlang der Mesenterium. 2. Präparieren und Befestigungsgewebesegmente Mit einem Skalpell geschnitten etwa 6 kleine Gewebesegmente (2 mm 2) aus dem distalen Kolon. Tun Sie dies auf einem Blatt of Dentalwachs und in einigen Tropfen PBS eingetaucht. Post-fix die Gewebesegmente in Fixierungslösung für 3 h bei 4 ° C. 3. Micro-Sezieren Gewebeblöcke Bereiten Sie 5% niedrig schmelzenden Agarose in PBS und halten Sie sie in einem Wasserbad bei 45 ° C. Die Gewebesegmente einbetten in 5% niedrig schmelzende Agarose mit einem kleinen Kunststoffbehälter, wie die Standard-Größe Tissue-Tek Cryomold. Montieren Sie die eingebetteten Abschnitte auf einer vibrierenden Klinge Mikrotom und füllen Sie die Pufferwanne mit eiskaltem PBS. Cut 300 um Gewebestreifen bei 0,8 Amplitude und 0,04 mm / s Geschwindigkeit. Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt werden die Gewebestreifen aus der Agarose verdrängt werden. Re-Einbettung 300 um Gewebestreifen in Agarose und montieren sie am Mikrotom senkrecht zur Vibratom Klinge. Mit einem Vibratom geschnitten Gewebestreifen in einer Dicke von 50 um. Hinweis: Die endgültige Gewebeblöcke sollten etwa 300 & mgr; m breit x 50 & mgr; m dick sein. Diese dbmessungen von Pilot konfokalen Experimente, die zeigten, dass die Dicke der enteroendokrinen Zelle zwischen 15-20 um und die neuropod der Länge von 30 bis 70 nm optimiert. Daher könnte eine gesamte Zelle in einem Gewebeblock 300 um Breite und 50 um Dicke enthalten sein, wenn die Ausrichtung der Zelle parallel zu der Fläche der Gewebeblock ist. Variieren diese Dimensionen je nach Gewebe und Zelltyp von Interesse. Die Gewebeblöcke in PBS bei 4 ° C. 4. Die konfokale Imaging Bereiten Sie eine Kernfärbung DAPI-Lösung durch Verdünnung in PBS bei 1: 4.000. Inkubieren Gewebeblöcke in DAPI Kernfärbung für 5 min. Anmerkung: DAPI-Färbung erleichtert Scheidungs ​​einzelnen Zellen durch ihre Kerne, die hilfreich zum Korrelieren der konfokale SBEM Bildern ist. Berg Gewebeblöcke auf geladene Objektträger aus Glas, ein paar Tropfen von PBS, und decken Sie sie mit einem Deckglas. Mit einem konfokalen Mikroskop identifizieren Blocks mit intakter Villi und PyyGFP Zellen von Interesse und bebildert sie z-Stacks optische Schnitte zu erhalten. Verwenden Sie eine 20-fach / 0,8 Zeiss Plan Apochromat Ziel, z-Stacks von 1 um optische Schnitte zu erhalten. Zur Z-Stapel, verwenden die Kanäle für 405 nm (DAPI), um die Beziehung zu anderen Zellen zu bestimmen, auf 488 nm endogenen GFP die Zelle von Interesse zu lokalisieren, und die Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) an Stelle der Zelle in Bezug auf die Bestimmung Lumen. Verwenden Sie Bildauflösung von 1024 Pixel oder höher. 5. Embedding Blocks in Agarose Herstellung von 10 ml Fixiermittel, enthaltend 4% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in PBS. Die Gewebeblöcke vom Glas-Objektträger zu entfernen durch vorsichtige Zugabe von PBS in den Kanten des Deckglases an das Deckglas ohne Beschädigung der Gewebeblock aus dem Glasträger zu gleiten. Verwenden Sie dann eine schöne Kunstmalerpinsel, um das Gewebe Block von der Folie, um eine 1 übertragen0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, enthaltend 4% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd Fixativ. Post-fix Gewebeblöcke O / N bei 4 ° C. Übertragen Gewebeblöcke auf PBS. Dann einbetten Blöcke flach in 5% niedrig schmelzende Agarose durch sandwich sie zwischen zwei Glasobjektträger. Hinweis: Einbetten der Blöcke in einer dünnen Schicht von Agarose erleichtert posterior Manipulation während der Färbung. Schneiden Sie die Agarose in einem Quadrat und eine Kerbe auf der oberen Seite. Anmerkung: Dieser Schritt ist notwendig, um die Ausrichtung in den folgenden Schritten erhalten. Speicher Blöcke in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung. Serienblock Gesicht Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) In diesem Abschnitt wird die Gewebeblock hergestellt und mit SBEM abgebildet bei niedriger Vergrößerung. Das Übersichtsbild der Blockfläche wird dann mit den konfokalen Daten korreliert, um die Region, die die Zelle von Interesse zu identifizieren. Sobald die Regionidentifiziert ist, wird das Gewebe bei einer Auflösung von 7 nm / Pixel und Scheiben von 70 nm abgebildet. Dies war ausreichend, um zu beheben und zu unterscheiden groß dichten Kern sekretorischen Vesikeln aus anderen Organellen. In enteroendokrinen Zellen variiert diese Art von Vesikel zwischen 100 und 150 nm im Durchmesser, 13. Das Protokoll ist wie folgt: 6. Färbung Gewebeschnitten Entfernen Gewebe aus PBS und spülen dreimal jeweils 5 Minuten in 0,1 M Cacodylatpuffer. Fleckenblöcke für 1 h in 0,1% Gerbsäure in 0,1 M Cacodylat-Puffer gelöst, um den Kontrast von Zellmembranen 14 verbessern. Führen Sie nachfolgende Färbung und Austrocknung von Gewebe nach dem veröffentlichten Protokoll 11. Folgende Deerinck et al. Protokoll, bereiten diese Lösungen: 1) 1% (w / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) führen Aspartat-Lösung; 3) 1% Uranylacetat und 4) osmium tetraoxyde / Kaliumferrocyanid (OsO 4 / K Ferrocyanide). Mischen Sie 4% OsO 4 und 2xK Ferrocyanide stock [0,3 g K Ferrocyanide und 0,86 g Na Cacodylat in 10 ml H 2 O] im Verhältnis 1: 1 OsO 4 / K Ferrocyanide zu machen. Hinweis: Nachdem die in Agarose eingebetteten Gewebe erleichtert die Handhabung während der Färbung. Agarose für nachfolgende Harzinfiltration vorsichtig entfernen. Spülen Proben dreimal jeweils 5 Minuten in 0,1 M Cacodylatpuffer und dann Fleck mit OsO4 / K-Ferrocyanid Lösung für 2 Stunden bei 4 ° C. Spülen in Reinstwasser dreimal mit je 5 min, und Fleck mit TCH für 30 min bei 60 ° C. Spülen in Reinstwasser dreimal, jeweils 5 min und Fleck mit 2% OsO 4 (kein Ferrocyanid K) für 60 min bei RT. Wieder spülen in ultrareinem Wasser dreimal mit je 5 min. Fleck mit 1% Uranylacetat O / N bei 4 ° C. Spülen in Reinstwasser dreimal mit je 5 min. Fleck mit Blei Aspartat für 30 min bei 60 ° C. Spülen in Reinstwasser dreimal mit je 5 min. Dehydratisieren Gewebe durch Spülen in solutions mit steigenden Konzentrationen von Ethanol. Spülen 2 mal jeweils 5 Minuten mit 50%, 75%, 85%, 95% und 100% absoluten Ethanol. Am Ende gründlich Abschnitte mit Propylenoxid zweimal, jeweils 10 Minuten. 7. Als Spion and Embedding Gewebeschnitte in Resin Infiltrieren, die Blöcke mit Harz unter Verwendung der kommerziell avaialble kit. Betten Sie Gewebe in Harz mit einem EPON Einbettung kit. Vorbereitung einer Harzmischung aus 48% Epoxid, 20% ml DDSA, 30% NMA ml und 2% DMP30. Agitieren Harzgemisch 5 min kräftig und legen Sie dann mix im Vakuum für 30 Minuten, damit Luftblasen an die Oberfläche zu kommen. Mischen Sie Harz mit Propylenoxid bei 1: 1-Verhältnis und kräftig schütteln. Entfernen Sie die endgültige Austrocknung Spülen von Geweben und fügen Harz vermischt mit Propylenoxid. Platz Fläschchen mit Proben in einem Rotator O / N und lassen Fläschchen nicht begrenzten. Am nächsten Tag, fügen Sie frisch zubereitete EPON-Harz und Mischen für 90 min in Rotator. Betten Sie Blöcke in Harz so flach wie möglich durch Einfügen sie inzwischen Glasobjektträgern, die mit flüssigem Trennmittel ausgehärtet sind, um sie von aneinander kleben 15 verhindern. Sobald die Blöcke Flach eingebettet, heilen die Bausteine ​​für eine zusätzlich 48 Stunden bei 60 ° C. Ziehen Sie gleitet auseinander, um die Blöcke zu lösen. 8. Montage und Trimmen des Tissue-Block für Imaging Unter einem Binokular, passen Sie die Ausrichtung der Gewebeblöcke in Harz mit dem der konfokalen mikroskopischen Aufnahmen eingebettet, um zu erleichtern die Identifizierung der Bereiche, die Zellen von Interesse enthält vor dem Trimmen den Block. Schneiden Sie das Harz eingebettet Block manuell bis zu einer ~ 500 x 500 & mgr; m-Block-face. Montieren Sie den Block flach auf einem Stift, die leitfähige Epoxidharz und trocken für 30 Minuten. Dann lag der Block flach auf einer Oberfläche und trocken O / N bei 60 ° C. Mantel der Block mit kolloidalem Silber Flüssigkeit. Pflegen Sie die Gewebeschnitte flach Schneiden des Blocks in einem rechten Winkel zu gewährleisten, um die Zusammenarbeit zu erleichtern,rrelating die Serienblock-face und konfokale Mikroaufnahmen. 9. SBEM Bild der Block mit einem Rasterelektronenmikroskop ausgestattet mit einem SBEM System (z .B., 3View). Set Ausgangsdicke Schnitt bei ~ 2 & mgr; m-Schritten und schneiden, bis das Gesicht des Gewebes ergibt sich aus dem Block. Erwerben Sie eine Surver Bild des gesamten Block Gesicht. Verwendung Fiji Software, Messungen sowohl die Serienblock-face und konfokale Mikroaufnahmen, einen gemeinsamen Nenner und machen Musterkettenschär während Fixierung und Färbung 16 zu erzeugen. Suchen Sie den Bereich von Interesse auf der Blockfläche durch Multiplikation der Nenner auf die Koordinaten in den konfokalen Bildern. Verwenden auch andere strukturelle Merkmale, wie die Position der Mikrovilli, Becherzellen oder der Lamina propria als Referenz. Bild Region von Interesse in eine 2,25 kV und 7 nm / Pixel (oder 15,147X Vergrößerung) in Hochvakuum-Modus. Slice-Schritten festgelegt werden solltenbei 70 nm oder weniger. Sammeln SBEM-Daten im 16-Bit-.dm3 Format. 10. Optimieren SBEM Images für Oberflächensegmentierung Konvertieren SBEM Bilder von rohen .dm3 Format in 8-Bit-TIFF. TIFF Filtern von Bildern mit einem 0,8 Gaußsche Unschärfe-Filter in Fidschi. Verkleinern Sie die Daten auf 25% der Originalgröße festgelegt und speichern Sie sie als TIFF-Stapel, die Menge an RAM-Speicher erforderlich, um den Satz zu behandeln minimieren. Richten Sie den Stapel SBEM Bilder mit der Fidschi-Plugin "linear Stapel Ausrichtung mit SIFT" im Übersetzungsmodus und beschnitten mit der "Ernte 3D" Plugin. Hinweis: Cropping hilft, die Menge an RAM-Speicher erforderlich weiter verringert für die Segmentierung und Volume-Rendering. Daten Rendering in 3D 11. konfokale Mikroskopie Rekonstruieren z-Stapel mit der automatische treffen Modus des "Oberflächen" Werkzeug. 1D zeigt eine reconstruction jedes Kanals mit Hilfe der glatten Option, die Oberflächen-Bereich Detail auf 0,126 & mgr; m und Schwellen als absolute Intensität. 12. Serienblock Gesicht SEM Hinweis: Die manuelle Datensegmentierung ist ein sehr zeitaufwändiges Verfahren und in Abhängigkeit von den Merkmalen, das Verfahren kann mehrere Wochen dauern gerendert werden. Die Segmentierung für die Videos und Figuren in Bohórquez et al. 2014 8 wurde manuell durchgeführt und dauerte etwa 500 Stunden der Arbeit. Es wird empfohlen, die wesentlichen Merkmale benötigen Rendering vor Beginn der Segmentierungsprozess zu priorisieren. Die Vorgehensweise ist wie folgt: Verwenden Sie die "Oberflächen" Werkzeug in Zeichenmodus und die "Kontur" -Option im Zeichenmodus von 50 ms bis Segment manuell und Volumen machte die Zelle von Interesse. Spuren Konturen auf jede Scheibe der Zelle für glattere Rendering oder alle 5 Scheiben für schnelleres Rendering. Export im FinaleAlter mit Hilfe der "Schnappschuss" Werkzeug bei einer Auflösung von 300 dpi oder mehr.