Corrélative confocale et microscopie électronique 3D d'une cellule sensorielle spécifique

Tous les soins des animaux et expériences ont été réalisées conformément à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Duke. Cocem3D découle d'une combinaison de protocoles précédemment publiés 10,11 et a été appliqué ici pour étudier une cellule entéroendocrine spécifique en utilisant un journaliste souris PyyGFP 12. Ce procédé peut facilement être appliqué à d'autres cellules d'intérêt en utilisant des souris transgéniques rapporteuses disponibles dans le commerce. La méthode est décrite en trois sections: microscopie corrélative confocale, microscopie électronique à balayage bloc-face série (SBEM), et de données de rendu en 3D. Corrélative microscopie confocale L'objectif de cette section est de récolter un segment de tissu du côlon distal des dimensions qui permettent confocale corrélative et l'imagerie SBEM. Le protocole est le suivant: 1. Exploitation du Tissue Préparer10 ml de solution / ml d'héparine 50 ug dans du PBS. Préparer xylazine / kétamine anesthésique en mélangeant 10 ml de kétamine (100 mg / ml) et 1 ml de xylazine (20 mg / ml). Diluer xylazine / kétamine stock 1: 4 à 0,1 M PBS. Préparer une solution de 100 ml de fixatif contenant 4% de paraformaldehyde et 0,1% de glutaraldéhyde dans du PBS. Anesthésier une souris PyyGFP, âgés de 6 à 10 semaines, avec une dose létale de xylazine / kétamine anesthésique. Injecter l'anesthésique par voie intraperitoneale à 0,15 ml par 20 g de poids de la souris. Confirmez anesthésie appropriée de la souris en pinçant la queue ou des orteils, et d'utiliser la pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Utilisez un flux pompe péristaltique variable pour perfuser fixateur intracardiaque 10. Avec des ciseaux chirurgicaux (13 cm de longueur) coupe ouvrir la cavité abdominale pour exposer les intestins, le cœur et les poumons. Tenez coeur avec une pince étroite motif incurvé (12 cm de longueur) et insérer une aiguille à ailettes (19 G) de la pompe péristaltique iNto ventricule gauche. Immédiatement, couper l'oreillette droite avec des ciseaux droites de printemps (longueur 4 mm). Perfuser à un débit de 2 ml / min d'abord avec une solution d'héparine pendant 1 min, puis avec une solution de fixateur glacée pendant 15 minutes jusqu'à ce que la queue de la souris est tout à fait rigide. Remarque: Il est très important pour perfuser à un rythme lent à empêcher l'éclatement des petits vaisseaux de la muqueuse intestinale. Débordant de navires va compromettre l'ultrastructure du tissu. Si la perfusion est adéquate, le foie doit pâlir de couleur dans 3-5 min. Utilisation de petits ciseaux ouvrir la cavité abdominale et de l'accise de la totalité du côlon de la jonction avec le caecum au rectum distale. Placez le tissu dans du PBS glacé. Bien immergé dans PBS, couper ouverte avec de petits ciseaux de printemps du côlon long du mésentère. 2. Dissection et de fixation segments de tissu En utilisant un scalpel, couper environ six segments de tissu de petite taille (2 mm 2) dans le côlon distal. Pour ce faire, sur une feuille ocire dentaire f et immergé dans quelques gouttes de PBS. Post-fixer les segments de tissu dans la solution de fixation pendant 3 heures à 4 ° C. 3. blocs de tissus micro-dissection Préparer 5% bas point de fusion d'agarose dans du PBS et le garder dans un bain d'eau à 45 ° C. Incluez les segments de tissu dans 5% à faible point de fusion agarose en utilisant un petit récipient en plastique, comme la taille standard Tissue-Tek cryomoule. Montez les sections embarqués sur un microtome à lame vibrante et remplir le bac tampon avec PBS glacé. Couper 300 um bandes de tissu à 0,8 amplitude et 0,04 mm de vitesse / sec. Remarque: À ce stade, les bandes de tissus seront délogés de l'agarose. Re-intégrer 300 bandes de tissu de um dans l'agarose et les monter sur microtome perpendiculairement à la lame de l'vibratome. L'utilisation d'un vibratome, couper des bandes de tissu à une épaisseur de 50 um. Remarque: Les blocs de tissus définitifs devraient être d'environ 300 m de large x 50 um d'épaisseur. Ces dimensions sont optimisées à partir d'expériences pilote confocaux qui ont montré que l'épaisseur de la cellule entéroendocrine est comprise entre 15 à 20 um et une longueur de 30 à 70 nm de l'neuropod. Par conséquent, une cellule entière puisse être contenue dans un bloc de tissu de 300 um de largeur et 50 um d'épaisseur si l'orientation de la cellule est parallèle à la face du bloc de tissu. Ces dimensions varient selon le tissu et la cellule type d'intérêt. Stockez les blocs de tissus dans du PBS à 4 ° C. 4. imagerie confocale Préparer une solution de colorant nucléaire en diluant DAPI dans du PBS à 1: 4000. Incuber blocs de tissus dans DAPI colorant nucléaire pendant 5 min. Remarque: coloration DAPI facilite la distinction des cellules individuelles par leurs noyaux, ce qui est utile pour mettre en corrélation les images confocales et SBEM. Blocs de tissus de montage sur lame de verre chargée, ajouter quelques gouttes de PBS, et les couvrir avec une lamelle. En utilisant un microscope confocal, identifier blocs de villosités intact et cellules PyyGFP d'intérêt et de les imager pour obtenir z-piles sections optiques. Utilisez un objectif 20X / 0,8 plan Zeiss Apochromat pour obtenir z-piles de 1 um sections optiques. Pour le z-stack, utiliser les canaux de 405 nm (DAPI) pour déterminer la relation à d'autres cellules, 488 nm GFP endogène de localiser la cellule d'intérêt, et contraste d'interférence différentiel (DIC) pour déterminer l'emplacement de la cellule par rapport à la lumen. Utilisez une résolution d'image de 1024 pixels ou plus. 5. incorporation blocs dans Agarose Préparer 10 ml de fixatif contenant 4% de paraformaldehyde et 2,5% de glutaraldéhyde dans du PBS. Retirez les blocs de tissus provenant de la lame de verre, en ajoutant prudemment PBS dans les bords de la lamelle à glisser la lamelle loin de la lame de verre sans endommager le bloc de tissu. Ensuite, utilisez un pinceau de beaux-arts de transférer le bloc de tissu de la diapositive à un 10,5 ml de tube à centrifuger contenant du paraformaldéhyde 4% et 2,5% de glutaraldéhyde fixateur. Blocs de tissus post-fix O / N à 4 ° C. Transfert blocs de tissus à PBS. Ensuite, incorporer blocs plats dans 5% d'agarose bas point de fusion en les prenant en sandwich entre deux lames de verre. Note: Intégrer les blocs dans une mince couche d'agarose facilite la manipulation postérieure pendant la coloration. Couper le agarose dans un carré et de faire une encoche sur le côté supérieur de la main. Remarque: Cette étape est nécessaire pour maintenir l'orientation dans les étapes suivantes. blocs de magasins dans un tube de 1,5 ml avec du PBS à 4 ° C jusqu'à leur traitement ultérieur. Serial Numérisation Bloc-face Electron Microscopy (SBEM) Dans cette section, le bloc de tissu est préparé et imagée avec SBEM à faible grossissement. L'image de l'enquête de la face du bloc est ensuite corrélée avec les données confocale pour identifier la région contenant la cellule d'intérêt. Une fois la régionest identifié, le tissu est imagée avec une résolution de 7 nm / pixel et des tranches de 70 nm. Ce fut suffisant pour résoudre et de distinguer les grands-dense vésicules de sécrétion de base à partir d'autres organites. Dans les cellules entéro-endocrines, ce type de vésicules varie entre 100 et 150 nm de diamètre 13. Le protocole est le suivant: 6. Les articles de tissus coloration Retirer le tissu de PBS et rincer trois fois, cinq minutes à chaque fois, dans du tampon 0,1 M de cacodylate. blocs de taches pour l'acide tannique 1 h en 0,1% dissous dans un tampon cacodylate 0,1 M pour augmenter le contraste des membranes cellulaires 14. Procéder à la coloration et la déshydratation subséquente de tissu selon le protocole publié 11. Suite à Deerinck et al. protocole, de préparer ces solutions: 1) 1% (p / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) conduire solution aspartate; 3) l'acétate d'uranyle à 1%, et 4) le ferrocyanure tetraoxyde d'osmium / de potassium (OsO 4 / K ferrocyanure). Mélanger 4% OsO 4 et 2xK Ferrocyanide stocks [0,3 g K Ferrocyanide et 0,86 g Na cacodylate dans 10 ml H 2 O] au rapport 1: 1 de faire OsO 4 / K Ferrocyanide. Remarque: Avoir le tissu incorporé dans agarose facilite la manipulation au cours de la coloration. Retirez délicatement agarose pour l'infiltration subséquente de résine. Rincer les échantillons trois fois, 5 min chacune, dans un tampon cacodylate 0,1 M puis tache avec une solution OsO4 / K Ferrocyanide pendant 2 h à 4 ° C. Rincer à l'eau ultra pure trois fois, 5 minutes chacun, et la tache avec TCH pendant 30 min à 60 ° C. Rincer à l'eau ultra pure trois fois, 5 minutes chacun et tache avec 2% OsO 4 (pas K Ferrocyanide) pendant 60 min à température ambiante. Rincer à nouveau en eau ultra pure trois fois, 5 minutes chacun. Colorer avec 1% d'acétate d'uranyle O / N à 4 ° C. Rincer à l'eau ultra pure trois fois, 5 minutes chacun. Colorer avec aspartate plomb pendant 30 min à 60 ° C. Rincer à l'eau ultra pure trois fois, 5 minutes chacun. Déshydrater les tissus par rinçage dans solutions avec des concentrations croissantes d'éthanol. Rincer deux fois, cinq minutes à chaque fois, avec 50%, 75%, 85%, 95% et 100% d'éthanol absolu. A la fin, rinçage sections avec l'oxyde de propylene, deux fois 10 min chacun. 7. infiltrant and Embedding coupes de tissus dans Résine Infiltrer les blocs avec de la résine en utilisant le kit commercialement avaialble. Intégrer les tissus en résine en utilisant un kit d'encastrement epon. Préparer un mélange de résine époxy de 48%, 20% DDSA ml, 30 ml NMA%, et 2% DMP30. Agiter vigoureusement le mélange de résine pendant 5 minutes et ensuite placer mélange sous vide pendant 30 min pour permettre à des bulles montent à la surface. Mélanger la résine avec de l'oxyde de propylène au rapport 1: 1 et agiter vigoureusement. Retirer le rinçage de la déshydratation finale des tissus, et ajouter résine mélangée avec de l'oxyde de propylène. Lieu flacon avec des échantillons dans un rotateur O / N et laisser flacon non bouché. Le lendemain, ajouter résine EPON fraîchement préparé et mélanger pendant 90 min dans la coiffe. Intégrer blocs en résine aussi plat que possible en les prenant en sandwich dansentre des lames de verre qui ont été durcis avec un agent de libération de liquide pour les empêcher de coller les uns aux 15 autres. Une fois que les blocs sont intégrés plat, guérir les blocs pour une addition de 48 h à 60 ° C. Tirez diapositives à part pour libérer les blocs. 8. Montage et Recadrage de l'bloc de tissu pour l'imagerie Sous un microscope à dissection, correspondre à l'orientation des blocs de tissus inclus en résine avec celle des micrographies confocales pour faciliter l'identification des régions contenant les cellules d'intérêt avant de couper le bloc. Coupez le bloc de résine embarqué bas manuellement à un um îlot ~ 500 x 500. Monter le bloc à plat sur une broche contenant époxy et sec conducteur pendant 30 min. Ensuite, mettre le bloc à plat sur une surface sèche et O / N à 60 ° C. Enduire le bloc avec le liquide de l'argent colloïdal. Maintenir les sections de tissus plat afin de garantir le tranchage du bloc à angle droit pour faciliter la coopérationrrelating les micrographies série d'îlot et confocale. 9. SBEM L'image du bloc en utilisant un microscope électronique à balayage équipé d'un système de SBEM (e .g., 3view). Réglez l'épaisseur de coupe initiale à ~ 2 um incréments et coupé jusqu'à ce que le visage de tissu émerge du bloc. Acquérir une image de Surver de l'ensemble du visage de bloc. En utilisant le logiciel Fidji, prendre des mesures à la fois le bloc-face et confocale série micrographies pour générer un dénominateur et compte commun pour l'échantillon le déformer lors de la fixation et la coloration 16. Localisez la zone d'intérêt sur la face du bloc en multipliant le dénominateur pour les coordonnées dans les images confocales. Utilisez également d'autres caractéristiques structurelles, comme la position de microvillosités, cellules caliciformes ou lamina propria, comme une référence. région de l'image d'intérêts à un 2,25 kV et 7 nm / pixel (ou 15,147X grossissement) en mode à vide élevé. incréments de Slice devraient être fixésà 70 nm ou moins. Recueillir des données en format RAW SBEM .dm3 16-bit. 10. Optimisation SBEM Images pour la segmentation de surface Convertir des images de format SBEM .dm3 brut à 8 bits .tiff. Filtrez .tiff images en utilisant un filtre de 0,8 flou gaussien à Fidji. Réduire l'ensemble à 25% de la taille originale des données et l'enregistrer comme une pile .tiff pour minimiser la quantité de mémoire RAM nécessaire pour gérer l'ensemble. Alignez la pile d'images SBEM utilisant le plugin Fidji "d'alignement de la pile linéaire avec des EIPD», au mode de traduction et recadrée en utilisant le plugin "culture 3D". Note: Le rognage permet de réduire davantage la quantité de mémoire RAM nécessaire pour la segmentation et le rendu de volume. Rendu des données en 3D 11. microscopie confocale Reconstruire z-piles en utilisant le mode automatique de l'outil "surfaces" surpassent. Figure 1D, montre une reconstruction de chaque canal en utilisant l'option lisse, le détail de la zone des surfaces à 0,126 um, et d'un seuil que l'intensité absolue. 12. série Bloc-face SEM Remarque: Les données Manuel segmentation est une procédure très coûteuse en temps et en fonction des caractéristiques d'être rendus à la procédure peut prendre plusieurs semaines. Segmentation pour les vidéos et les chiffres présentés dans Bohórquez et al 2014 8. A été fait manuellement et a pris environ 500 heures de travail. Il est recommandé de donner la priorité aux caractéristiques essentielles nécessitant rendu avant de commencer le processus de segmentation. La procédure est la suivante: Utilisez le "surfaces" outil en mode de traction et l'option "contour" au mode de 50 ms dessin de segmenter manuellement et rendu de volume de la cellule d'intérêt. Tracer les contours sur chaque tranche de la cellule pour un rendu plus lisse ou toutes les 5 tranches pour un rendu plus rapide. Export im finaleâges en utilisant l'outil «instantané» à une résolution de 300 dpi ou plus.