متلازم متحد البؤر و3D المجهر الإلكتروني لخلية حسية معينة
Summary
Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.
Abstract
ترسيم التركيب الدقيق للخلية مهم لفهم وظيفتها. يمكن أن يكون هذا المشروع شاقة لأنواع الخلايا نادرة تنتشر في جميع أنحاء الأنسجة المصنوعة من أنواع الخلايا المختلفة، مثل الخلايا enteroendocrine من ظهارة الأمعاء. وكانت هذه المجسات الجهاز الهضمي من الطعام والبكتيريا من الصعب دراسة لأنها فرقت بين الخلايا الظهارية الأخرى بنسبة 1: 1000. مؤخرا، تم إنشاؤها الفئران المعدلة وراثيا مراسل لتحديد الخلايا enteroendocrine عن طريق مضان. واحد من هؤلاء هو الببتيد YY-GFP الماوس. باستخدام هذا الفأر، قمنا بتطوير طريقة لربط متحد البؤر والمسلسل كتلة وجه المجهر الإلكتروني. أطلقنا على هذه الطريقة cocem3D وتطبيقه لتحديد خلية enteroendocrine محددة في الأنسجة وكشف النقاب عن التركيب الدقيق للخلية في 3D. حل cocem3D غير كافية لتحديد عضيات صغيرة مثل الحويصلات الإفرازية وللتمييز أغشية الخلايا لحجم إعادةndering. Cocem3D يمكن تكييفها بسهولة لدراسة التركيب الدقيق 3D من أنواع معينة من الخلايا الأخرى في الأنسجة وطنهم.
Introduction
الحياة داخل خلية تحدث في الزمان والمكان. وغالبا ما تتم دراسة التغيرات على مر الزمن باستخدام المجهر مرور الزمن جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير مضان، مثل فائقة الدقة المجهر. الفضاء، ولا سيما ترتيب عضيات داخل الخلية أو الخلية الى خلية التفاعلات، لا يمكن إلا أن تستمد من خلال حساب كامل للبنية الخلية على ما يرام. يمكن حساب شامل لهيكل الخلية غرامة أيضا يجلب الوضوح الى وظيفة الجينوم في الحالات التي يكون فيها الجينوم هو متاح، مثل C. ايليجانس الخيطية 1 أو placozoa tricoplax شقة الملتصقة 2. المسلسل المجهر باجتزاء الإلكترون هو الآن استنساخه وفعالة وقت، وذلك بفضل مهمة أقل تكلفة لتطوير تكنولوجيات المجهر الإلكتروني 3D الآلي، مثل المسلسل كتلة وجه المسح الإلكترون المجهري 3 (SBEM).
الحاجة إلى المعلومات الهيكلية لتوضيح وظيفة واضحة جدا في سل معينأنواع لتر حيث تعتمد الدالة على المادية الخلية الى خلية التفاعلات، مثل الخلايا العصبية، الدبقية، أو الخلايا الظهارية الحسية. نحن مهتمون بشكل خاص في توضيح كيفية transduced إشارات حسية من المواد الغذائية في تجويف الأمعاء إلى إشارة كهربائية أن ينظم في نهاية المطاف السلوكيات مشهي. والدائرة هي معقدة ولكنها تبدأ في جدار الأمعاء حيث تأتي المواد الغذائية في اتصال مع الخلايا الظهارية الحسية، تسمى خلايا enteroendocrine. على عكس الخلايا الظهارية الحسية الأخرى، مثل الخلايا الذوقية، وفرقت الخلايا enteroendocrine في جميع أنحاء ظهارة الأمعاء في نسبة 1-1000 4-7. ونتيجة لذلك، فقد كان من الصعب تحديد ودراسة، ومنذ فترة طويلة أنها كان ينظر فقط كمصدر للهرمونات القناة الهضمية. ولكن مع تطور الفئران مراسل مضان خلية محددة، وظيفة حسية معقدة من هذه الخلايا في الظهور. باستخدام أحد هذه الفئران المراسل، الببتيد YY-GFP (PyyGFP) الماوس، وجدنا أن enteroendocrالمعهد الوطني للإحصاء الخلايا لها ذيل حشوية البارز الذي نحن اسمه neuropod. ظهور neuropods اقترح وظيفة الحفظ في خلية الاتصال إلى الخلية. وبالتالي، فإننا معللة ذلك من خلال توثيق التركيب الدقيق للخلية enteroendocrine، ويمكن أن تستمد وظيفة neuropods.
وكانت الحاجة إلى فهم هيكل ذيلا في زنزانة فرقت التي من الصعب تحديد المبرر الرئيسي لتطوير طريقة للجمع بين المجهري متحد البؤر وSBEM. تم التعرف على خلية ذات الاهتمام باستخدام PyyGFP enteroendocrine خلية محددة الفئران مراسل. سمح لنا طريقة لتوثيق التركيب الدقيق الكامل للخلية enteroendocrine وneuropod لها. ضمن neuropods، وجدنا السمات الهيكلية من المحاور العصبية، وخارج neuropods، وجدنا علاقة جسدية لالدبقية المعوية 8. في الواقع، neuropods تحتوي على حوالي 70٪ من جميع الحويصلات الإفرازية يشير دورا أساسيا في وظيفة إفرازية من هذه الخلايا. بناء علىالبيانات الهيكلية، وفي الآونة الأخيرة وجدنا أنه من خلال هذه neuropods، خلايا enteroendocrine والخلايا العصبية التعصيب الأمعاء تشكيل الدائرة الظهارية العصبية، مماثلة لتلك التي من خلايا الذوق في اللسان 8،9.
كشف مثل هذه السمات آليات حسي كيميائي الجهاز الهضمي تنبع من البيانات الهيكلية التي تم جمعها باستخدام هذا الأسلوب المجهري مترابط. ونعتقد أن هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة في مناطق أخرى من بيولوجيا الخلايا، لا سيما عندما فرقت الخلايا داخل الأنسجة في نسبة منخفضة جدا. أشرنا إلى الأسلوب كما متحد البؤر مترابط ومتسلسل كتلة وجه المجهر الإلكتروني في 3D (Cocem3D). يتكون أسلوب الخطوات الرئيسية التالية: تشريح الأنسجة، والفحص المجهري متحد البؤر، والتصوير SBEM، SBEM ومتحد البؤر ارتباط الصورة، وتجزئة اليدوية. بالمقارنة مع الطرق المترابطة أخرى، فإن مفهوم بسيط إلى حد ما لأن الإرتباط المادي بدلا من المواد الكيميائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
chemosensation الهضمي يبرز بوصفه مجالا جديدا ومثيرا في مجال البحوث الطبية الحيوية. هذا هو في جانب كبير منه بسبب اكتشاف مستقبلات الذوق وظيفية في الخلايا enteroendocrine 18. وقد أظهرت الدراسات اللاحقة أن الخلايا enteroendocrine تعبر عن مستقبلات معينة على المواد الغذائية، بما في ذلك الكربوهيدرات، والدهون، والأحماض الأمينية 5،6،19،20. وكان العامل المحفز لهذه الاكتشافات تطوير الفئران المراسل، في الخلايا التي enteroendocrine وfluorescently المسمى 20. وضعنا واحد من هذه الفئران، والفأر PyyGFP، لدراسة الخلايا enteroendocrine من الأمعاء الدقيقة القاصي والقولون 17،21. هذه الخلايا هي التي تهم لأنها تفرز PYY ومثل الجلوكاجون الببتيد 1، وكلاهما المحرضات بالشبع 22،23. في ذلك الوقت، كان حساب فائقة الهيكلي الكامل لهذه الخلايا في عداد المفقودين، والتي كنا نعتقد أمر أساسي لفهم آليات يشير الخاصة بهم.
ontent "> هنا، وصفنا على طريقة بصريا لسد متحد البؤر المجهري مع SBEM. ويشار إلى الأسلوب كما Cocem3D، الأمر الذي سمح لنا لتوثيق التركيب الدقيق الكامل للخلايا enteroendocrine. لقد ذكرت أن هذه الخلايا لديها neuropod يحتوي على ثلاثة أرباع كل من الحويصلات الإفرازية 8. وفي neuropod، هناك neurofilaments ومثل الكثير من المحاور العصبية، ورعايتها من قبل neuropods الخلايا الدبقية المعوية 8. والأهم من ذلك، هو على الرغم من هذه neuropods أن enteroendocrine خلايا الاتصال فعليا إلى الخلايا العصبية التعصيب الأمعاء و القولون 9.واحدة من نقاط القوة في cocem3D هو بساطته. الحد من عينة الأنسجة في كتلة التي يمكن تصويرها من قبل مبائر وSBEM يسهل التعرف على خلية معينة داخل الأنسجة. ويمكن تحديد الحويصلات الإفرازية وعضيات أخرى بكل سهولة في القرار 7 نانومتر / بكسل. لأنه يتم التخلص منها المقاطع في SBEM، المزيد من بروسسالغناء من الأنسجة لتحديد بروتينات معينة ليس خيارا في هذه المرحلة. ومع ذلك، وتطوير أساليب مثل آتوم 24، التي يتم الاحتفاظ المقاطع من كتلة الأنسجة، ومن المرجح أن تمكين من التعرف على بروتينات معينة في الخلية. تحديد موقع محدد من المستقبلات حسي كيميائي على خلايا enteroendocrine هي المعلومات الأساسية لتطوير علاجات العقاقير لعلاج السمنة، لأن الخلايا enteroendocrine هي واجهة الحسية بين الطعام في القناة الهضمية والشبع في الدماغ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Bohórquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.
Materials
| Phosphate buffered saline | Life technologies | 10010023 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4 |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882 | |
| Dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Low-melting agarose | Life technologies | 16520-100 | 5%, freshly made in PBS |
| Standard Tissue-Tek Cryomold | Electron Microscopy Sciences | 62534-25 | |
| DAPI nuclear stain | Life technologies | D1306 | |
| Postively charged glass slides and coverslips | |||
| Fine art paintbrush #1 | |||
| Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11650 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
| EMbed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Liquid releasing agent | Electron Microscopy Sciences | 70880 | |
| Liquid silver colloidal | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| CircuitWorks conductive epoxy | ITW Chemtronics | CW2400 | |
| Variable flow peristaltic pump | VWR | 70730-064 | |
| VT1200S Vibrating blade microtome | Leica | ||
| Zeiss 780i confocal microscope | Carl Zeiss | ||
| Sigma VP Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss | ||
| 3view system | Gatan | ||
| Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) | http://www.renovoneural.com | Renovo provides 3d EM services | |
| Fiji software | Open access software | ||
| Computer station with 16GB of RAM or more | |||
| Data visualization software Imaris 7.5 | Bitplane |
References
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
- Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329 (2004).
- Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
- Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
- Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
- Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881 (2014).
- Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. , (2015).
- Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
- Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. . NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).
- Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
- Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
- Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
- Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
- Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
- Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
- Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
- Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).
