La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos
Summary
This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.
Abstract
Durante el desarrollo, las células hematopoyéticas se derivan de un subconjunto especializado de las células endoteliales, el endotelio hemogenic (HE). HE desarrollo Modeling in vitro es esencial para estudios mecanísticos de la transición-endotelial hematopoyético y especificación hematopoyético. Aquí se describe un método para la inducción eficiente de SE a partir de células humanas pluripotenciales (hPSCs) mediante la sobreexpresión de diferentes conjuntos de factores de transcripción. La combinación de ETV2 y GATA1 o GATA2 TFS se utiliza para inducir HE con potencial de pan-mieloide, mientras que una combinación de factores de transcripción y GATA2 TAL1 permite la producción de HE con eritroide y megacariocítica potencial. La adición de LMO2 a GATA2 y la combinación TAL1 acelera sustancialmente la diferenciación y aumenta células eritroides y megacariocíticos producción. Este método proporciona un medio eficiente y rápida de HE inducción de hPSCs y permite la observación del endotelio hematopoietic transición en una placa de cultivo. El protocolo incluye procedimientos hPSCs transducción y análisis post-transducción de SE y progenitores de sangre.
Introduction
La capacidad única de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para auto-renovarse y diferenciarse en células de las tres capas germinales, incluyendo sangre, que sean una herramienta valiosa para los estudios sobre el mecanismo de desarrollo hematopoyético, el modelado de enfermedades de la sangre, la detección de drogas, Los estudios de toxicidad y el desarrollo de terapias celulares. Debido a la formación de la sangre en los embriones producto de endotelio hemogenic (HE) a través de una transición hematopoyético endotelial 1,2, la generación de la ES en culturas sería esencial para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la endotelial a la transición hematopoyético y especificación hematopoyético. Los métodos actuales para estudios de HE se basan en la inducción de la diferenciación hematoendothelial en los agregados (EBS) con la adición de citoquinas hematopoyéticas 3-5, y de cocultivo con células estromales hPSCs-hematopoyesis de apoyo 6,7 o en cultivos de dos dimensiones con extracelular matrices y moldes cytokines 8,9. Estos métodos de diferenciación clásicos se basan en la introducción de señales externas que actúan en la superficie celular y que inician cascadas de vías moleculares que eventualmente conducen a la activación de programa transcripcional guiar el desarrollo hematoendothelial. Por lo tanto, la eficiencia de hPSCs diferenciaciones en estos sistemas se basa en una inducción efectiva de esas señales, la transducción de señales al núcleo, y la activación resultante de reguladores transcripcionales específicos. Además, el estudio de HE en cultivos de diferenciación convencionales requiere la etapa adicional de aislamiento de células HE usando la clasificación de células. Aquí se describe un protocolo sencillo para la inducción directa de HE y sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción hematopoyéticas. Este método permite la inducción eficiente de HE en un plato y la observación directa del endotelial a la transición hematopoyéticas sin la necesidad de aislamiento de HE utilizando un procedimiento de clasificación de células engorroso.
Formación de SE y la sangre a partir de células madre pluripotentes humanas pueden ser inducidas de manera eficiente mediante la sobreexpresión a pocos factores de transcripción (TFS). La combinación óptima de TFS capaces de inducir robusta hematopoyesis-pan mieloide de hPSCs incluye ETV2 y GATA1 o GATA2. En contraste, la combinación de GATA2 y TAL1 induce erythromegakaryocytopoiesis 10. Programación hPSCs través de la sobreexpresión de estos factores que diferencia hPSCs directamente a la VE-cad + CD43 – CD73 – células HE que adquieren gradualmente el fenotipo hematopoyético definirse por la expresión de principios del CD43 marcador hematopoyético 7. Este método basado en lentiviral para la programación directa del método de pluripotentes células madre humana es aplicable para la generación de HE y las células de sangre para estudios mecanísticos, estudios de endotelial a la transición hematopoyético, y la regulación transcripcional de desarrollo hematopoyético y especificación. Aunque la current protocolo describe la producción de sangre usando la expresión constitutiva de los transgenes, resultados similares podrían obtenerse utilizando ARNm modificado 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método anteriormente descrito para la diferenciación hematopoyética de hPSCs por la sobreexpresión de TFS, representa un enfoque rápido y eficiente para la generación de HE y mieloides y erytho magakaryocytic progenitores de hESCs y CMPI, permitiendo así la producción de hasta 30 millones de células de sangre de un millón de células madre pluripotentes 10. Este método exhibió diferenciación consistente en múltiples células madre y iPSCs líneas 10. Durante la diferenciación por …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.
Materials
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture.
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ –>3’ | Reverse (Rev) 5’–>3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | — | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | — | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | — | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | — | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | — | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | — | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
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