A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco
Summary
This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.
Abstract
Durante o desenvolvimento, as células hematopoiéticas surgem a partir de um subconjunto especializado de células endoteliais, endotélio hegemônicos (HE). Desenvolvimento de modelagem HE in vitro é essencial para estudos sobre os mecanismos da transição endotelial-hematopoiético e especificação hematopoiético. Aqui, nós descrevemos um método eficiente para a indução de HE partir de células humanas estaminais pluripotentes (hPSCs) por meio de sobre-expressão de diferentes conjuntos de factores de transcrição. A combinação de ETV2 e GATA1 ou GATA2 TF é utilizado para induzir HE com potencial pan-mielóide, enquanto uma combinação de factores de transcrição e GATA2 TAL1 permite a produção de HE com eritróide e potencial megacariocítica. A adição de LMO2 para GATA2 combinação e TAL1 acelera e aumenta substancialmente a diferenciação eritróide e células megacariocíticas produção. Este método proporciona um meio eficiente e rápida de indução HE de hPSCs e permite a observação do endotélio-hematopoietitransição C numa placa de cultura. O protocolo inclui procedimentos de transdução hPSCs e análise pós-transdução de HE e progenitores do sangue.
Introduction
A capacidade única de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para auto-renovar e diferenciar em células das três camadas germinativas, incluindo sangue, torná-los uma ferramenta valiosa para os estudos sobre os mecanismos de desenvolvimento hematopoiético, modelagem de doenças do sangue, despistagem de drogas, Os estudos de toxicidade, e ao desenvolvimento de terapias celulares. Porque a formação do sangue no embrião receitas provenientes endotélio hegemônicos (HE) por meio de uma transição endotelial hematopoiéticas 1,2, a geração de HE em culturas seria essencial para estudar os mecanismos moleculares que regulam a endotelial a transição hematopoiético e especificação hematopoiético. Os métodos actuais para estudos de HE baseiam-se na indução de diferenciação hematoendothelial em agregados (EBS) com a adição de citocinas hematopoiéticas 3-5, e de co-cultura com células estromais hPSCs hematopoiese 6,7-suporte ou em culturas bidimensionais com extracelular matrizes e cytokines 8,9. Estes métodos clássicos de diferenciação são baseadas na introdução de sinais externos que actuam na superfície da célula e iniciar a cascata de vias moleculares que conduzem eventualmente à activação transcricional de programa que controla o desenvolvimento hematoendothelial. Assim, a eficiência do hPSCs diferenciações nestes sistemas depende de uma indução eficaz desses sinais, a transdução de sinal para o núcleo, e a resultante activação da transcrição específicas de reguladores. Além disso, o estudo de HE em culturas de diferenciação convencionais requer o passo adicional de isolar as células HE utilizando separação de células. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a indução direta de HE e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição hematopoiéticas. Este método permite a indução eficiente de HE em um prato e a observação directa da endotelial de transição hematopoiética sem a necessidade de isolamento de HE utilizando um procedimento de separação de células pesado.
Formação de HE e sangue a partir de células-tronco pluripotentes humanas podem ser eficientemente induzida pela superexpressão apenas alguns fatores de transcrição (TFS). A combinação ideal de TFs capazes de induzir robusto hematopoiese pan-mielóide de hPSCs inclui ETV2 e GATA1 ou GATA2. Em contraste, a combinação de GATA2 e TAL1 induz erythromegakaryocytopoiesis 10. Programação hPSCs através da superexpressão desses fatores diferencia hPSCs diretamente para o VE-cad + CD43 – CD73 – HE células que gradualmente adquirir o fenótipo hematopoiéticas definido pela expressão do marcador CD43 cedo hematopoiéticas 7. Este método baseia-lentiviral para a programação directa das células estaminais pluripotentes humanas método é aplicável para a geração de HE e células do sangue para os estudos mecanicistas, estudos de transição para endotelial e hematopoiética, a regulação da transcrição de desenvolvimento hematopoiético e especificação. Embora o Current protocolo descreve a produção de sangue usando a expressão constitutiva dos transgenes, resultados semelhantes podem ser obtidos utilizando modificado mRNA 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método acima descrito para a diferenciação hematopoiética da hPSCs por sobre-expressão de TF, representa uma abordagem rápida e eficiente para a geração de HE e mielóides e erytho-magakaryocytic progenitores de hESCs e iPSCs, permitindo assim a produção de até 30 milhões de células de sangue de um milhão de células-tronco pluripotentes 10. Este método exibiu diferenciação consistente em várias linhas de células estaminais embrionárias humanas e IPSCs 10. Durante a diferencia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.
Materials
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture.
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ –>3’ | Reverse (Rev) 5’–>3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | — | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | — | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | — | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | — | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | — | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | — | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
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