Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

Die einzigartige Fähigkeit des menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sich selbst zu erneuern und sich in Zellen der drei Keimblätter, einschließlich Blut zu unterscheiden, machen sie ein wertvolles Werkzeug für die mechanistische Studien von hämatopoetischen Entwicklung, Modellierung von Blutkrankheiten, Wirkstoff-Screening, Toxizitätsstudien und die Entwicklung von Zelltherapien. Da die Blutbildung im Embryo Erlöse aus hemogenic Endothel (HE) durch eine endotheliale hämatopoetischen Gangs ^1,2, die Erzeugung von HE in Kulturen wäre sehr wichtig, um die molekularen Mechanismen, die zur Regelung der Endothelzellen zu hämatopoetischen Übergangs und hämatopoetischen Spezifikation zu studieren. Derzeitigen Methoden für die Untersuchung der ER auf der Induktion von Differenzierung in hematoendothelial Aggregate (EVG) mit dem Zusatz von hämatopoetischen Cytokinen ^3-5 und Cokultur hPSCs mit Hämatopoese-stützende Stromazellen ^6,7 oder zweidimensionalen Kulturen mit extrazellulären basierend Matrizen und cytokines ^8,9. Diese klassischen Differenzierung Methoden basieren auf der Einführung von Schauspiel an der Zelloberfläche und die Einleitung Kaskaden von molekularen Signalwege, die schließlich zur Aktivierung von Transkriptionsprogramm Führungs hematoendothelial Entwicklung führen externe Signale. Somit stützt sich der Wirkungsgrad hPSCs Differenzierungen in diesen Systemen auf einem effektiven Induktion von jenen Signalen, die Signaltransduktion in den Zellkern und die resultierende Aktivierung spezifischer Transkriptionsregulatoren. Darüber hinaus ist die Untersuchung von HE in herkömmlichen Differenzierungskulturen erfordert den zusätzlichen Schritt der Isolierung von HE-Zellen unter Verwendung der Zellsortierung. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die direkte Induktion von HE und Blut durch die Überexpression von hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren. Dieses Verfahren ermöglicht die effiziente Induktion HE in eine Schale und eine direkte Beobachtung der endothelialen hämatopoetische Übergang ohne die Notwendigkeit zur Isolierung von HE mit einem umständlichen Zellsortierungsverfahren.

Bildung HE und Blut von menschlichen pluripotenten Stammzellen können effizient durch Überexpression nur wenige Transkriptionsfaktoren (TFs) induziert werden. Die optimale Kombination von Transkriptionsfaktoren, die zur Induktion robust pan-myeloischer Blutbildung aus hPSCs umfasst ETV2 und GATA1 oder GATA2. Im Gegensatz dazu Kombination GATA2 und TAL1 induziert erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmieren hPSCs durch Überexpression dieser Faktoren unterscheidet hPSCs direkt an das VE-cad ⁺ CD43 ^– CD73 ^– HE Zellen, die stufenweise den hämatopoetischen Phänotyp durch Expression von frühen hämatopoetischen Marker CD43 ⁷ definiert erhalten. Diese lentiviralen basierendes Verfahren für die direkte Programmierung der menschlichen pluripotenten Stammzellen Verfahren ist anwendbar zur Erzeugung von HE und Blutzellen für mechanistische Studien, Studien endothelialer hämatopoetische Übergang und transkriptionale Regulation der hämatopoetischen Entwicklung und Spezifikation. Obwohl der current Protokoll beschreibt die Blutbildung mit konstitutiver Expression der Transgene, könnten ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von modifizierten mRNA ¹⁰ erhalten werden.